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Documento PDF (Tesi di Dottorato ) - [email protected]
Sede Amministrativa: Università degli Studi di Padova
Dipartimento di Scienze Oncologiche e Chirurgiche
SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN
Oncologia e Oncologia Chirurgica
XXII CICLO
Il programma tollerogenico delle cellule soppressorie di origine
mieloide dipende dal fattore di trascrizione C/EBPβ
Direttore della Scuola: Ch.mo Prof. Paola Zanovello
Supervisore: Dott. Vincenzo Bronte
Dottorando: Ilaria Marigo
A Fabrizio
e alle nostre famiglie
INDICE
SUMMARY
1
RIASSUNTO
3
SCOPO DELLA TESI
5
INTRODUZIONE
7
Immunosorveglianza ed “immunoediting”.
7
Cellule mieloidi soppressorie (MDSC)
10
Immunosoppressione
13
Arginasi 1 (ARG1)
16
Ossido nitrico sintetasi 2 (iNOS/NOS2)
16
Cooperazione Arg1 e Nos2
17
Fenotipo e sottopolazioni delle MDSC murine
21
Le MDSC nell'uomo
23
Meccanismi di attivazione
31
Immunoterapia passiva: il successo del trasferimento adottivo degli effettori
immunitari CD8+
34
Targeting immunoterapeutico: inibizione dell’attività delle MDSC
36
Utilizzo terapeutico delle MDSC
38
MATERIALI E METODI
41
RISULTATI
53
Definizione dei fattori solubili che rilasciati nel microambiente tumorale sono in grado
di influenzare la mielopoiesi.
53
Caratterizzazione delle MDSC indotte in vitro mediante trattamento con citochine. 55
Attività immunoregolatorie delle MDSC differenziate dal BM del topo.
59
Il fattore trascrizionale C/EBPβ è indispensabile per il programma
immunosoppressivo delle MDSC differenziate in vitro dal BM o indotte dal tumore. 68
DISCUSSIONE
79
BIBLIOGRAFIA
85
ABBREVIAZIONI
101
SUMMARY
Tumor growth is associated with a profound alteration of myelopoiesis, leading to recruitment of
immunosuppressive cells known as myeloid-derived suppressor cells (MDSCs). Analyzing the
cytokines affecting myelo-monocytic differentiation produced by various experimental tumors,
we found that GM-CSF, G-CSF and IL-6 allowed a rapid generation of MDSCs from precursors
present in mouse bone marrow (BM). BM-MDSCs induced by GM-CSF+IL-6 possessed the
highest tolerogenic activity, as revealed by their ability to impair priming of IFN-γ-producing
CD8+ T cells upon in vivo adoptive transfer. Moreover, adoptive transfer of syngeneic, GMCSF+IL-6-conditioned MDSCs to diabetic mice transplanted with allogeneic pancreatic islets
resulted in long term allograft acceptance and correction of the diabetic status. Cytokines
inducing MDSCs acted on a common molecular pathway. Immunoregulatory activity of both
tumor-induced and BM-derived MDSCs was entirely dependent on C/EBPβ transcription factor,
a key component of the emergency myelopoiesis triggered by stress and inflammation. Adoptive
transfer of tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes resulted in therapy of established tumors
only in mice lacking C/EBPβ in myeloid compartment. These data unveil another link between
inflammation and cancer and identify a novel molecular target to control tumor-induced immune
suppression.
1
2
RIASSUNTO
La crescita tumorale è associata ad una profonda alterazione della mielopoiesi, che porta al
reclutamento di cellule immunosoppressive conosciute come cellule soppressorie di origine
mieloide (Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs). Analizzando le citochine prodotte da vari
tumori sperimentali, e che influenzano la differenziazione mielo-monocitaria, abbiamo trovato
che GM-CSF, G-CSF e IL-6 permettono la rapida generazione di MDSC dai precursori presenti
nel midollo di topo. Le MDSC derivate in vitro da colture di midollo osseo con la combinazione di
citochine GM-CSF+IL-6, possiedono la più forte attività tollerogenica, e sono in grado, dopo
trasferimento adottivo in vivo, di limitare l’attivazione dei linfociti T CD8+ secernenti IFN-γ.
Inoltre il trasferimento adottivo di MDSC singeniche, ottenute impiegando le citochine GM-CSF
ed IL-6, in topi resi diabetici e trapiantati con insule pancreatiche allogeniche permette
l’accettazione del trapianto allogenico a lungo termine e la relativa modificazione dello stato
diabetico. Le citochine che inducono MDSC agiscono attraverso una via molecolare comune.
L’attività immunoregolatoria sia delle MDSC indotte dal tumore sia di quelle indotte in vitro dal
midollo osseo risulta interamente dipendente dal fattore di trascrizione C/EBPβ, un componente
chiave della mielopoiesi di emergenza innescata da stress ed infiammazione. Il trasferimento
adottivo di linfociti T CD8+ specifici verso antigeni del tumore garantisce la terapia di tumori
stabilizzati solamente nei topi che mancano di C/EBPβ nel comparto mieloide. Questi dati
svelano un ulteriore legame tra infiammazione e cancro e identificano un nuovo bersaglio
molecolare per controllare l’immunosoppressione indotta dal tumore.
3
4
SCOPO DELLA TESI
Il nostro gruppo di ricerca si occupa da anni dello studio di una popolazione di cellule
soppressorie di origine mieloide, recentemente denominate “Myeloid-derived suppressor cells”
(MDSCs). Le MDSCs sono state caratterizzate nei topi portatori di tumore come una
popolazione estremamente eterogenea di cellule mielo-monocitarie che presentano i marcatori di
superficie CD11b and Gr-1 (Ly6C/G) e che sono responsabili di un blocco funzionale e
proliferativo dei linfociti T CD8+ e CD4+ stimolati dall’antigene (Marigo, Dolcetti et al. 2008;
Gabrilovich and Nagaraj 2009). L’ipotesi attualmente accettata prevede che, nel topo, la
generazione delle MDSC, a partire da precursori presenti in organi ematopoietici quali il midollo
osseo e la milza, sia mediata dall’azione di vari fattori rilasciati nel microambiente tumorale.
Tuttavia, non è ancora stato chiarito in modo esauriente quali siano i fattori solubili e
trascrizionali principalmente coinvolti nella loro generazione e regolazione.
L’obiettivo di questo progetto di ricerca è lo studio del differenziamento delle MDSC a partire da
precursori midollari. I risultati ottenuti ci consentiranno da un lato di poter sfruttare la loro
potente attività tollerogenica per controllare le risposte immunitarie indesiderate contro antigeni
self o alloantigeni presenti negli organi trapiantati e dall’altro di interferire con la loro generazione
in caso di immunoterapia dei tumori.
Abbiamo precedentemente dimostrato che la breve somministrazione in vivo di GM-CSF murino
è sufficiente ad indurre un incremento transitorio di cellule CD11b+/Gr-1+ e così bloccare la
risposta di cellule T CD8+ stimolata dagli antigeni (Bronte, Chappell et al. 1999). Inoltre, la
transfezione di una linea cellulare di melanoma che non esprime costitutivamente GM-CSF con
un vettore retrovirale codificante la citochina è sufficiente ad indurre l’espansione di cellule
CD11b+/Gr-1+ nella milza e indurre disfunzioni immunitarie dei CTL quando i cloni
ingegnerizzati di melanoma vengono inoculati nei topi (Bronte, Chappell et al. 1999). Più
recentemente, abbiamo dimostrato che il silenziamento del GM-CSF in un carcinoma mammario
provocava la riduzione delle MDSC e la completa abrogazione dell’immunosoppressione
sistemica indotta da tumore (Dolcetti, Peranzoni et al. 2009). In particolare, il GM-CSF guida
l’espansione delle sottopolazioni CD11b+/Gr-1int e CD11b+/Gr-1low nella milza dei topi portatori
di tumore e queste sottopolazioni sono quelle principalmente responsabili della tolleranza indotta
dal tumore. Sebbene questi ed altri dati (Serafini, Carbley et al. 2004) abbiano chiaramente
evidenziato il ruolo del GM-CSF nel controllare le MDSC in vivo, i tentativi di generare MDSC
pienamente competenti dai precursori del midollo osseo (BM) utilizzando esclusivamente questa
citochina non hanno avuto pieno successo. Il GM-CSF, inoltre, presente nel microambiente
tumorale non è la sola citochina che induce mielopoiesi.
5
Abbiamo quindi deciso di indagare le citochine più presenti nel microambiente tumorale per
identificare la minima combinazione di fattori richiesta per la generazione delle MDSC in vitro. Le
MDSC così generate sono state quindi caratterizzate fenotipicamente e funzionalmente per la
loro capacità di indurre immunosoppressione in vitro e tolleranza in vivo.
Un altro aspetto della ricerca ha riguardato lo studio dei fattori di trascrizione coinvolti nei
processi di differenziamento mieloide. Abbiamo scelto di studiare in particolare C/EBPβ, un
membro della famiglia dei fattori di trascrizione C/EBP, che comprende fattori coinvolti in
maniera differente nella granulopoiesi. In particolare, mentre C/EBPα è il principale regolatore
della granulopoiesi nello “steady-steate”, C/EBPβ ha invece un ruolo critico nella granulopoiesi
in condizioni di emergenza, in cui C/EBPα non risulta attivato (Hirai, Zhang et al. 2006).
Abbiamo quindi deciso di valutare se C/EBPβ fosse necessario per il programma
immunosoppressivo delle MDSC ottenute dal midollo in vitro o indotte dal tumore.
6
INTRODUZIONE
Immunosorveglianza ed “immunoediting”.
Negli anni settanta del secolo scorso Burnet e Thomas hanno proposto la teoria
dell’immunosorveglianza, che ha gettato le basi per lo studio della relazione tra sistema
immunitario e crescita neoplastica. Secondo Burnet, i neo-antigeni specifici delle cellule tumorali
avrebbero provocato una reazione immunologica capace di eliminare la neoplasia emergente
(Burnet 1964); secondo Thomas, inoltre, gli organismi più evoluti avrebbero dovuto possedere
dei meccanismi di protezione verso i tumori, simili a quelli che mediano il rigetto allogenico. Il
sistema immunitario, quindi, sarebbe stato in grado di sorvegliare costantemente i tessuti
dell’ospite dall’emergere di cellule trasformate (Burnet 1970). Questa teoria, è stata presto
abbandonata a causa dei risultati discordanti dovuti all’utilizzo di modelli di immunodeficienza
imperfetti, ed è stata sucessivamente recuperata nella seconda metà degli anni novanta, in seguito
ad esperimenti che dimostrarono l’importanza di diverse componenti del sistema immune, sia
innato che adattativo, nel controllo della trasformazione neoplastica.
L’immunosorveglianza era concepita come un processo binario, di completa o mancata
protezione dell’ospite, agente solo nelle fasi precoci della comparsa del tumore. In realtà, il
sistema immunitario sembra avere un ruolo più complesso, da un lato di contrasto dello sviluppo
tumorale e dall’altro di rimodellamento della neoplasia nel corso della sua progressione.
Esperimenti con tumori trapiantabili in topi parentali (“wild type”) o RAG-2-/- (che mancano di
enzimi coinvolti nel riarrangiamento dei recettori linfocitari e nella riparazione di danni al DNA
espressi esclusivamente nel comparto linfoide e sono privi di linfociti B, T), ad esempio, hanno
mostrato che i tumori sviluppatisi in assenza di un sistema immunitario intatto sono più
immunogenici di tumori cresciuti in ospiti immunocompetenti (Shankaran, Ikeda et al. 2001).
L’ambiente immunologico seleziona varianti tumorali che hanno maggiori possibilità di
sopravvivere in un ospite immunocompetente per la ridotta immunogenicità o perché hanno
acquisito meccanismi di evasione o soppressione del sistema immunitario. Questo processo è
favorito dall’instabilità genetica intrinseca delle cellule tumorali e la selezione interessa sopratutto
i geni codificanti antigeni tumorali, componenti del complesso maggiore di istocompatibilità o
componenti della via di segnalazione del recettore per l’IFN-γ.
Il rimodellamento immunologico del tumore avviene continuamente, anche se gli effetti maggiori
di quest’azione si hanno verosimilmente nelle fasi precoci di crescita, quando il tumore non è
ancora rilevabile clinicamente. Per descrivere il comportamento del sistema immunitario è stato
perciò proposta una nuova definizione, quella di “cancer immunoediting”, comprendente tre fasi
principali: eliminazione, che può dare completa distruzione del tumore e risoluzione del processo
7
senza avanzamento verso le fasi successive; equilibrio, in cui cellule tumorali geneticamente
instabili sopravvissute sono selezionate, dai linfociti e da molecole chiave nell’immunità innata ed
adattativa come IFN-γ, in base alla maggiore resistenza all’attacco immune; “escape”, in cui le
varianti che hanno acquisito insensibilità all’eliminazione iniziano ad espandersi in modo
incontrollato, originando tumori clinicamente osservabili. Il grado di rimodellamento del tumore
probabilmente dipende dal tipo di cellule operative durante la fase di equilibrio, e questo
suggerisce che gli eventi possano essere differenti per ogni tessuto di origine (Dunn, Bruce et al.
2002).
Figura 1. Le tre fasi del processo di “cancer immunoediting.
(A) Leliminazione corrisponde allo stadio di immunosorveglianza antitumorale.
(B) L’equilibrio rappresenta la fase durante cui il sistema immunitario seleziona e promuove l’insorgenza di
varianti tumorali con un’aumentata capacità di eludere la risposta immune.
(C) L’ escape o evasione è il momento in cui il sistema immunitario non riesce più a contenere l’espansione del
tumore, che cresce in maniera incontrollata.
Nella figura sono rappresentate in grigio le cellule di tessuto sano; in blu le cellule tumorali, ed in rosso ed arancione
le varianti tumorali di nuova insorgenza. Figura tratta e modificata da Dunn et al. (2002) “Cancer immunoediting:
from immunosurveliance tot umor escape:”, Nat Immunol
La fase di evasione inizia quando l’equilibrio tra il sistema immune ed il tumore si sposta a favore
della crescita neoplastica, a causa dell’esaurimento della risposta immunitaria o della sua
inibizione, grazie alla comparsa di varianti tumorali in grado di sottrarsi alla pressione esercitata
dal sistema immune. Le alterazioni delle cellule tumorali riguardano soprattutto i meccanismi di
processazione e presentazione antigenica o la via di segnalazione del recettore per IFN-γ. Queste
alterazioni riducono, da una parte, il riconoscimento degli antigeni tumorali e la conseguente
eliminazione delle cellule positive (“tumor ignorance”). Inoltre, la progressiva selezione aumenta
8
anche la capacità delle cellule neoplastiche di ostacolare attivamente le funzioni protettive del
sistema immunitario. Quest’ultimo processo può derivare dalla sovrapproduzione da parte delle
cellule trasformate di citochine inibitorie, quali TGF-β o IL-10 (Khong and Restifo 2002), o altri
inibitori della risposta dei linfociti T, come la galectina-1 (Rubinstein, Alvarez et al. 2004) ed
indoleamina 2,3-diossigenasi (IDO) (Uyttenhove, Pilotte et al. 2003), oppure da modificazioni nel
reclutamento e nel differenziamento di diverse popolazioni cellulari.
Il sistema immunitario ha evoluto parecchi meccanismi e popolazioni cellulari per controllare la
sua attivazione ed indurre tolleranza verso le cellule T autoreattive. Il tumore può impiegare a suo
vantaggio questi stessi meccanismi: ad esempio, può indurre un differenziamento alterato delle
cellule dendritiche (DC) in fenotipi più immaturi non funzionali (iDC). In pazienti affetti da tipi
diversi di tumore, ad esempio, è stata riscontrata una notevole diminuzione delle DC ed una
prevalenza, tra queste, di fenotipi immaturi che esprimono livelli bassi o nulli di molecole
costimolatorie (CD80, CD86). Un numero ridotto di cellule presentanti l’antigene (APC) rende la
stimolazione immune poco efficace e la presenza di iDC, che non forniscono un adeguato
segnale costimolatorio alle cellule T, può provocare anergia dei linfociti T. È stato proposto che
diversi fattori derivanti dal tumore, tra cui VEGF, IL-10, IL-6 e M-CSF, attivando
costitutivamente il fattore trascrizionale STAT3 ed inibendo NF-kB (nuclear factor kB), siano
responsabili di questo blocco maturativo delle DC che contribuisce alla soppressione di risposte
immuni tumore-specifiche (Gabrilovich 2004). Sono principalmente tre le popolazioni che
agiscono da regolatrici della risposta immunitaria: le T regolatorie (Treg) ovvero cellule T
CD4+CD25+FOXP3+, le cellule T Natural Killer (NKT) e le cellule mieloidi soppressorie
(MDSC). Queste diverse popolazioni agiscono impiegando meccanismi che non prevedono il
riconoscimento antigenico e, attualmente, sta emergendo come un'interazione tra queste diverse
popolazioni cellulari sia un'importante evento della regolazione negativa della risposta immune.
Le cellule Treg sono state inizialmente riscontrate in malattie autoimmuni, dove sembrano agire
sopprimendo la risposta autoreattiva mediata da linfociti T CD4+. Più recentemente si è scoperto
che queste cellule, costituenti circa il 10% dei linfociti T CD4+ circolanti in animali sani,
sopprimono la risposta immunitaria, mediata sia da linfociti T CD4+ che da CD8+, anche in
risposta a patogeni e tumori.
Le cellule Treg comprendono in realtà, una composita famiglia di cellule regolatorie. Tra queste
particolarmente studiate in campo dell'immunologia dei tumori sono le Treg naturali con
fenotipo CD4+CD25+FOXP3+. La deplezione di queste cellule in vivo, mediante l’impiego di
anticorpi anti-CD25 (PC61), prima del challenge col tumore, aumenta l’immunosorveglianza
mediata da CTL tumore-specifici, CD4+ e cellule NK, induce il rigetto di diversi tumori
9
immunogenici in vari ceppi murini ed aumenta l’efficacia di vaccini anti-tumorali (Onizuka,
Tawara et al. 1999). La presenza di queste cellule è stata riscontrata anche nell’uomo, con effetti
soppressori su linfociti T CD4+ e CD8+; in diversi pazienti affetti da tumore è stato riportato un
aumento della frazione di questa popolazione nel sangue periferico e, in tumori gastrointestinali,
la percentuale di CD4+ CD25+FOXP3+ sembra correlare inversamente con la prognosi (Sasada,
Kimura et al. 2003; Wolf, Wolf et al. 2003; Terabe and Berzofsky 2004). Le cellule NKT sono
una sottopopolazione di linfociti T implicata nella regolazione della risposta immunitaria associata
con malattie autoimmuni, malattie infettive e cancro. Riconoscono antigeni glicolipidici presentati
da molecole CD1d, attraverso un recettore TCR che comprende una catena α invariante. Inoltre,
possono regolare le risposte immunitarie sia promuovendo la secrezione di citochine Th1 e Th2
tra cui IFN-γ, IL-4 ed IL-13, o reclutando altre cellule immunosoppressive. Il meccanismo
immunosoppressivo sembra mediato dalla produzione di IL-13, che in topi con tumore è
aumentata rispetto agli animali naïve e che, agendo attraverso la via di IL-4Rα-STAT6, sopprime
l’azione di rigetto del tumore mediata dai CTL tumore-specifici. Probabilmente l’IL-13, anziché
agire direttamente sui CTL, induce le cellule mieloidi CD11b+Gr-1+ a produrre TGF-β, una
citochina che è in grado di sopprimere la funzione dei linfociti T CD8+ (Terabe, Matsui et al.
2000; Terabe and Berzofsky 2004). Infine, le cellule mieloidi soppressorie (MDSC) rappresentano
un altro effettore dell'immunosoppressione ed essendo oggetto di studio della presente tesi, sono
descritte di seguito in maniera più approfondita.
Cellule mieloidi soppressorie (MDSC)
Il termine cellule soppressorie di derivazione mieloide (abbreviato in MDSC) è stato
recentemente adottato per descrivere, nel modello murino, una popolazione cellulare che si
espande nel corso di alcune condizioni patologiche, quali infezioni, infiammazione cronica,
malattie autoimmuni e crescita neoplastica, che esprime i marcatori CD11b e Gr-1, bassi livelli di
marcatori di cellule mieloidi mature, up-regola geni legati al metabolismo di amminoacidi (come
la L-arginina) o coinvolti nella produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e dell’azoto
(RNS) e, soprattutto, è in grado di inibire la risposta immunitaria mediata da linfociti T, sia in vitro
che in vivo (Gabrilovich, Bronte et al. 2007; Dolcetti, Marigo et al. 2008; Marigo, Dolcetti et al.
2008; Gabrilovich and Nagaraj 2009; Ostrand-Rosenberg and Sinha 2009).
Nel topo, cellule con fenotipo CD11b+Gr-1+ sono presenti nel midollo osseo in percentuali del
40-50%, mentre sono assenti nei linfonodi e presenti a bassi livelli nella milza (circa 5% degli
splenociti) e nel sangue. In condizioni di normale mielopoiesi queste cellule derivano dalla
maturazione, indotta da diverse citochine (quali GM-CSF, IL-3, M-CSF, SCF ed Flt3) di cellule
10
staminali ematopoietiche e progenitori mieloidi, e migrano agli organi linfoidi secondari dove
maturano in macrofagi, granulociti e cellule dendritiche. In seguito a stimolazione antigenica
acuta, ad esempio durante un’infezione, questa popolazione mieloide si espande transientemente
a livello del midollo osseo e poi degli organi linfoidi secondari, dove probabilmente regola la fase
di contrazione della risposta immune, per evitare danni ai tessuti o auto-reattività provocati da
un’eccesiva attivazione dei linfociti T. Quando lo stimolo cessa, queste cellule differenziano
rapidamente nei tessuti, ripristinando la normale funzionalità linfocitaria. In caso di
infiammazione cronica o crescita tumorale, però, la stimolazione antigenica prolungata provoca
un accumulo massivo di cellule mieloidi che permangono negli organi linfoidi e nel sito tumorale,
mantenendo caratteristiche di immaturità e alterando la risposta immune in modo diretto e
indiretto, come riassunto in Tabella 1.
11
Tabella 1. Esempi di accumulo di MSC in diversi situazioni patologiche sperimentali.
Condizione
Fenotipo
Disfunzioni
Bibliografia
immunitarie
TUMORE
(Kusmartsev, Li et al. 2000; Salvadori,
Tumore trapiantabile (CNS5,
MethA, MCA-26)
CD11b/Gr-1
si
Martinelli et al. 2000; Gabrilovich, Velders
et al. 2001; Liu, Van Ginderachter et al.
2003)
(Bronte, Chappell et al. 1999; Bronte,
Tumore trapiantabile (TS/A, CT26)
CD11b/Gr-1/CD31
si
Apolloni et al. 2000; Bronte, Apolloni et al.
CD11b/His48a
si
(Prins, Scott et al. 2002)
CD31
si
(Young, Wright et al. 1996)
CD11b/Gr-1/CD31
si
(Melani, Chiodoni et al. 2003)
CD11b
si
(Horiguchi, Petersson et al. 1999)
2000; Dolcetti, Peranzoni et al. 2009)
Tumore trapiantabile (T9)
Tumore trapiantabile (LLC)
Tumore spontaneo (BALB/neu T
mice)
Carcinogenesi chimica
INFEZIONE
Candida Albicans
CD11b/Gr-1/CD80
si
(Mencacci, Montagnoli et al. 2002)
Trypanosoma Cruzi
CD11b/Gr-1
si
(Goni, Alcaide et al. 2002)
Schistosoma mansoni
CD11b/Gr-1/CD16
si
(Marshall, Jankovic et al. 2001)
CD11b/Gr-1/LFA-1
si
(Cauley, Miller et al. 2000)
CD11b/Gr-1/F4/80
si
(Terrazas, Walsh et al. 2001)
CD11b/Gr-1/CD31
si
STRESS IMMUNITARIO
Superantigeni (Staphylococcal
enterotoxin A)
Schistosome oligosaccharide
(Lacto-N-neotetraose)
Vaccinazione con virus
ricombinante
(Bronte, Wang et al. 1998; Bronte, Apolloni
et al. 2000)
INFIAMMAZIONE
CRONICA/AUTOIMMUNITA
’
Encefalomielite autoimmune
sperimentale
Uveoretinite autoimmune
sperimentale
Eczema cronico
Infiammazione cronica
dell’intestino
CD11b/Ly6Chigh/F4/8
si
(Zhu, Bando et al. 2007)
CD11b/Gr-1
si
(Kerr, Raveney et al. 2008)
CD11b/Gr-1/CD31
si
(Marhaba, Vitacolonna et al. 2007)
CD11b/Gr-1
si
(Haile, von Wasielewski et al. 2008)
CD11b/Gr-1/CD31
si
CD11b/Gr-1/Ly6-C
si
(Billiau, Fevery et al. 2003)
CD11b
si
(Bobe, Benihoud et al. 1999)
CD11b/Gr-1/CD31
si
0/CD93
ALTRI
Trattamento con ciclofosfamide
(fase di recupero)
Chimere midollari
Reazione graft-versus-host
Stress traumatico
12
(Angulo, de las Heras et al. 2000; Pelaez,
Campillo et al. 2001))
(Munera, Popovic et al.; Makarenkova,
Bansal et al. 2006)
Meccanismi pro tumorali delle MDSC
Durante la crescita neoplastica il continuo rilascio di citochine, fattori di crescita e chemochine
stimola l’ematopoiesi midollare, generando un progressivo accumulo di MDSC nel sangue, nella
milza e nel microambiente tumorale. Le MDSC così reclutate si inseriscono in una rete di
popolazioni infiammatorie che supportano con modalità differenti lo sviluppo tumorale, sia a
livello locale che sistemico (Coussens and Werb 2002; Balkwill and Coussens 2004)
Le MDSC oltre che ridurre la già scarsa risposta immune antitumorale contribuiscono con diversi
meccanismi alla crescita neoplastica. In primo luogo l’attivazione dell’enzima arginasi 1 in queste
cellule metabolizza L-arginina producendo poliammine, che possono contribuire direttamente alla
proliferazione delle cellule tumorali (Schmielau and Finn 2001; Belting, Borsig et al. 2002).
Inoltre, le MDSC possono danneggiare direttamente il DNA delle cellule circostanti
contribuendo alla trasformazione neoplastica, mediante il rilascio di specie reattive e
potenzialmente mutagene quali l’ossido nitrico, le specie reattive dell’ossigeno (ROS) e dell’azoto
(RNS). Negli ultimi anni, poi, le MDSC sono risultate coinvolte nei processi di angiogenesi e
invasione metastatica, come altre cellule ematopoietiche dell’infiltrato tumorale strettamente
correlate, quali macrofagi infiltranti il tumore (TAM) e monociti associati al tumore (TEM) (De
Palma, Murdoch et al. 2007; Murdoch, Muthana et al. 2008). Le cellule CD11b+Gr-1+ da topi con
tumore producono alti livelli di metalloproteasi 9 (MMP-9), una metalloproteasi della matrice che,
regolando la biodisponibilità di VEGF, agisce da fattore pro-angiogenetico. Inoltre, sotto
l’influenza di fattori rilasciati dal tumore le MDSC si incorporano direttamente nell’endotelio
tumorale, differenziando in cellule simili a quelle endoteliali (Yang, DeBusk et al. 2004). Le cellule
CD11b+Gr-1+ sono inoltre state associate nella resistenza a trattamento con anti-VEGF,
supportando ulteriormente il loro ruolo nel processo angiogenetico (Shojaei, Wu et al. 2007).
Infine, in due modelli di adenocarcinoma mammario, le MDSC possono promuovere l’invasione
tumorale locale e la metastatizzazione in un processo che coinvolge l’attività di diverse
metalloproteasi (Yang, Huang et al. 2008).
Immunosoppressione
L’ azione delle MDSC di inibizione degli effettori anti-tumorali è la funzione maggiormente e
studiata per queste cellule. Recentemente è stato ipotizzato dal nostro gruppo un modello
strutturato cronologicamente e topologicamente per ricapitolare le evidenze dell’ultimo decennio
riguardanti il processo dell’immunosoppressione (Marigo, Dolcetti et al. 2008) riassunto in figura
2. Nelle fasi iniziali di reclutamento mieloide dal midollo osseo e dalla milza (che nel topo può
fungere da organo ematopoietico indipendente), un ridotto numero di MDSC si trova a popolare
13
il microambiente tumorale, dove viene a contatto con gli antigeni associati al tumore (TAA).
Presentando tali antigeni, le MDSC interagiscono con i linfociti T CD8+ nei linfonodi drenanti,
causando un’iniziale stato di tolleranza verso i TAA. La crescita tumorale porta ad
un
progressivo aumento delle MDSC, che possono quindi inibire la risposta immune, sia verso TAA
che verso antigeni esogeni presentati da cellule presentanti l’antigene (APC), in modo sia
dipendente che indipendente dal complesso maggiore di istocompatibilità (MHC). In questa fase,
le MDSC possono attivare altre popolazioni cellulari regolatorie, come linfociti T regolatori
(Treg) o T-helper-17 (Th17), che contribuiscono a mantenere uno stato di soppressione
linfocitaria. Nelle fasi più avanzate, la presenza massiva di MDSC e altre popolazioni cellulari
induce uno stato di immunosoppressione generalizzata, nei confronti non solo di linfociti T
CD8+, ma anche di linfociti T CD4+, cellule natural killer (NK) e T natural killer (NKT).
Figura 2. Modello di tolleranza e immunosoppressione indotte dallo sviluppo neoplastico. (A) Le MDSC
vengono mobilizzate dai siti ematopoietici e infiltrano la massa tumorale in risposta a vari fattori solubili rilasciati dal
tumore (TDSF); qui vengono in contatto con antigeni tumorali (TAA) e le MDSC presentanti tali antigeni si
direzionano al linfonodo drenante. In questa sede le MDSC possono indurre tolleranza nei linfociti T CD8+,
provocando disfunzioni del TCR, anergia o apoptosi. In questa fase, dato l’esiguo numero di MDSC, l’impatto sui
linfociti è ancora limitato. (B) Nello stadio intermedio la crescita tumorale porta ad un progressivo aumento di
MDSC, che in questa fase possono indurre soppressione anche con meccanismo MHC-indipendente, sia verso TAA
che verso antigeni esogeni presentati dalle APC nei linfonodi drenanti. Altre popolazioni cellulari, quali linfociti Treg
o Th17, attivati dalle MDSC, possono contribuire e/o regolare l’immunosoppressione. (C) Come indicato nel
diagramma sulla destra, le MDSC diventano predominanti in stadi avanzati e possono indurre una soppressione
generalizzata, non più ristretta ai linfonodi drenanti, sia su linfociti T CD8+, che sui CD4+, cellule NK e NKT, verso
TAA e antigeni esogeni. Figura tratta e modificata da Marigo et al. (2008) “Tumor-induced tolerance and immune
suppressione by myeloid suppressor cells”. Immunological Reviews.
14
L’azione immunosoppressiva esercitata dalle MDSC sui linfociti è associata prevalentemente
all’attività di due enzimi, arginasi 1 (ARG1) e ossido nitrico sintetasi inducibile (iNOS o NOS2)
(Bronte and Zanovello 2005). ARG1 e NOS2 metabolizzano entrambi l’amminoacido L-arginina
dando origine a urea e L-ornitina o ossido nitrico (NO) e L-citrullina, rispettivamente (Bogdan
2001). Questi enzimi rispondono a stimoli tradizionalmente descritti come antitetici e
mutualmente esclusivi, ma ci sono evidenze che possano agire contemporaneamente ed in
sinergia nella popolazione MDSC (Gallina, Dolcetti et al. 2006) (Kusmartsev and Gabrilovich
2005), anche se ancora manca la dimostrazione formale che la stessa cellula possa attivare nello
stesso momento entrambe le proteine.
L’ossido nitrico sintetasi inducibile, invece, è una delle tre isoforme (le altre sono NOS1,
neuronale, e NOS3, endoteliale) di questo enzima, è espresso in macrofagi, neutrofili, eosinofili,
cellule dendritiche e cellule NK murine. NOS2 viene indotto soprattutto dalla citochina Th1
IFN-γ, in particolare in combinazione con LPS, ma anche dalle citochine infiammatorie IL-1,
TNF, IFN-α o IFN-β, che regolano diversi fattori di trascrizione, quali NF-kB, IFN-regulatory
factor 1 e STAT1 (Bogdan 2001; Ganster, Taylor et al. 2001). Il metabolismo dell’arginina nei
macrofagi è stato tradizionalmente utilizzato come importante parametro per discriminare tra
attivazione classica o alternativa di queste cellule. Le citochine Th1 IFN-γ e TNF-α, o i
lipopolisaccaridi batterici come LPS, determinando l’attivazione classica (M1) dei macrofagi,
caratterizzata da produzione di citochine ad azione pro-infiammatoria, stimolo dell’attività
microbicida e attivazione di cellule T citotossiche, stimolano il rilascio di NO mediante l’attività
di NOS2 e inibiscono l’attività di ARG1 indotta da IL-4, IL-10 o IL-13. Al contrario, citochine
Th2 quali IL-4, IL-10, IL-13, e TGF-β o glucocorticoidi, che inducono l’attivazione alternativa dei
macrofagi (M2), essenziale per l’immunità umorale, le risposte allergiche e antiparassitarie, la
riparazione dei tessuti e la fibrosi, inibiscono l’attività di NOS2 e inducono la sintesi di ARG1.
Tuttavia, questa dicotomia maturativa, applicabile a tutte le cellule accessorie di origine mieloide
(macrofagi, DC e polimorfonucleati), in base all’equilibrio tra NOS e ARG potrebbe costituire
una visione eccessivamente semplificata, non applicabile alle MDSC, che oltre ad utilizzare
entrambi gli enzimi sopracitati, co-esprimono marcatori macrofagici di attivazione classica e
alternativa (Gallina, Dolcetti et al. 2006). A seconda degli stimoli presenti nel microambiente
tumorale e della co-esistenza di diverse sottopopolazioni di MDSC, l’immunosoppressione può
essere infatti il risultato dell’attivazione sia separata che combinata di ARG1 e NOS2 (Bronte and
Zanovello 2005).
15
Arginasi 1 (ARG1)
Arginasi 1 (nota anche come arginasi epatica) è un enzima citosolico, espresso soprattutto negli
epatociti e coinvolto nel ciclo dell’urea, che viene indotta in cellule mieloidi murine da citochine
di tipo Th2 (Munder, Eichmann et al. 1999), quali IL-4 e IL-13, da TGF-β (Boutard, Havouis et
al. 1995) e GM-CSF (Jost, Ninci et al. 2003), a differenza dell’altra isoforma, arginasi 2 (o di tipo
renale) che è invece un enzima mitocondriale, costitutivamente espresso in cellule renali, neuroni,
macrofagi ed enterociti. Arginasi 1 viene espressa tramite vie di segnalazione dipendenti (Munera,
Popovic et al.; Gray, Poljakovic et al. 2005) e indipendenti (Sinha, Clements et al. 2005; El Kasmi,
Qualls et al. 2008)dal fattore di trascrizione STAT6.
Il coinvolgimento dell’enzima ARG1 nell’attività soppressiva delle MDSC è stato riscontrato in
diversi modelli tumorali (Bronte, Serafini et al. 2003; Gallina, Dolcetti et al. 2006; Rodriguez,
Quiceno et al. 2007). L’attivazione di arginasi 1 provoca una riduzione di L-arginina extracellulare
associata alla down-regolazione della catena CD3ζ del recettore dei linfociti T (T cell receptor,
TCR) con conseguente alterazione della segnalazione a valle, come dimostrato sia in vitro che in
vivo in modelli murini e in pazienti con tumore (Rodriguez, Zea et al. 2003; Baniyash 2004;
Rodriguez, Quiceno et al. 2004). Inoltre, la riduzione di L-arginina può alterare la traduzione e
causare arresto in fase G0-G1 del ciclo cellulare (Rodriguez, Quiceno et al. 2007). La deprivazione
di amminoacidi è un meccanismo importante di regolazione della risposta linfocitaria, come
dimostrano dati recenti che correlano la soppressione dell’attivazione dei CTL con la deplezione
di cisteina da parte delle MDSC (Srivastava, Sinha et al.) o con la riduzione di fenilalanina, indotta
da IL-4-induced gene 1 (IL4I1) (Boulland, Marquet et al. 2007), e del triptofano, causata da
indoleamina-2,3-ossigenasi (IDO) (Munn and Mellor 2007), ad opera di altre cellule mieloidi
regolatorie.
Ossido nitrico sintetasi 2 (iNOS/NOS2)
L’ossido nitrico sintetasi inducibile, invece, è una delle tre isoforme (le altre sono NOS1,
neuronale, e NOS3, endoteliale) di questo enzima, è espresso in macrofagi, neutrofili, eosinofili,
cellule dendritiche e cellule NK murine. NOS2 viene indotto soprattutto dalla citochina Th1
IFN-γ, in particolare in combinazione con LPS, ma anche dalle citochine infiammatorie IL-1,
TNF, IFN-α o IFN-β, che regolano diversi fattori di trascrizione, quali NF-kB, IFN-regulatory
factor 1 e STAT1 (Bogdan 2001; Ganster, Taylor et al. 2001). Il metabolismo dell’arginina nei
macrofagi è stato tradizionalmente utilizzato come importante parametro per discriminare tra
attivazione classica o alternativa di queste cellule.
16
Il ruolo immunoregolatorio dell’ossido nitrico (NO) rilasciato dalle MDSC è stato stabilito dalla
riduzione dell’immunosoppressione, sia in vitro che in vivo, mediante inibitori di NOS e
dall’osservazione che le MDSC di topi knock out per NOS2 mancano di capacità
immunosoppressiva (Mazzoni, Bronte et al. 2002). La soppressione dell’attivazione dei linfociti T
mediata da NO non è associata ad eventi precoci innescati dal riconoscimento antigenico da parte
del TCR, ma piuttosto alla cascata di segnalazione successiva al legame dell’IL-2 al proprio
recettore. L’ossido nitrico può regolare negativamente le proteine coinvolte nella segnalazione
intracellulare sia direttamente, tramite S-nitrosilazione di residui cisteinici cruciali, sia
indirettamente, attivando la guanilato ciclasi solubile e la protein chinasi dipendente da cGMP
(Bingisser, Tilbrook et al. 1998; Fisher, Pan et al. 2001). Nei linfociti T l’NO agisce bloccando la
fosforilazione, e quindi l’attivazione, di proteine coinvolte nelle tre principali vie di segnalazione
del recettore per l’IL-2 (JAK/STAT, Ras/MAPK, fosfoinositolo 3-chinasi/Akt), quali JAK1,
JAK3, STAT5, ERK a AKT (Pericle, Kirken et al. 1997; Mazzoni, Bronte et al. 2002). Studi su
cellule T umane hanno anche evidenziato come l’ NO influenzi inoltre la stabilità dell’mRNA
codificante per l’IL-2 e il rilascio di IL-2 da linfociti T attivati (Macphail, Gibney et al. 2003).
Cooperazione Arg1 e Nos2
Il coinvolgimento dell’enzima ARG1 nell’attività soppressiva delle MDSC è stato riscontrato in
diversi modelli tumorali (Bronte, Serafini et al. 2003; Gallina, Dolcetti et al. 2006; Rodriguez,
Quiceno et al. 2007). L’attivazione di arginasi 1 provoca una riduzione di L-arginina extracellulare
associata alla down-regolazione della catena CD3ζ del recettore dei linfociti T (T cell receptor,
TCR) con conseguente alterazione della segnalazione a valle, come dimostrato sia in vitro che in
vivo in modelli murini e in pazienti con tumore (Rodriguez, Zea et al. 2003; Baniyash 2004;
Rodriguez, Quiceno et al. 2004). Inoltre, la riduzione di L-arginina può alterare la traduzione e
causare arresto in fase G0-G1 del ciclo cellulare (Rodriguez, Quiceno et al. 2007). La deprivazione
di amminoacidi è un meccanismo importante di regolazione della risposta linfocitaria, come
dimostrano dati recenti che correlano la soppressione dell’attivazione dei CTL con la deplezione
di cisteina da parte delle MDSC (Srivastava, Sinha et al.) o con la riduzione di fenilalanina, indotta
da IL-4-induced gene 1 (IL4I1) (Boulland, Marquet et al. 2007), e del triptofano, causata da
indoleamina-2,3-ossigenasi (IDO) (Munn and Mellor 2007), ad opera di altre cellule mieloidi
regolatorie.
In condizioni di deplezione di L-Arg citosolica a causa dell’attività sovra-fisiologica dell’arginasi
presente nelle MDSC, l’attività di NOS2 viene modificata inducendo la produzione di anione
superossido (O2-) dal suo dominio reduttasico, oltre a NO (Xia and Zweier 1997; Xia, Roman et
17
al. 1998; Bronte, Serafini et al. 2003)). L’O2- reagisce poi con altre molecole generando intermedi
reattivi dell’azoto, noti anche come RNOS (reactive nitrogen-oxide species), tra cui i perossinitriti
ONOO- e specie reattive dell’ossigeno, i ROS (reactive oxygen species), tra cui il perossido di
idrogeno H2O2.
I perossinitriti prodotti dalla reazione tra O2- e NO sono agenti ossidanti altamente reattivi che
possono attraversare le membrane e danneggiare diversi target biologici. I perossinitriti possono
agire da perciò da messaggeri intra- e inter-cellulari e indurre modifiche post-traduzionali,
mediante la nitrazione di residui di tirosina, cisteina, metionina e triptofano delle proteine,
influenzando diverse attività biologiche, come l’attivazione/inattivazione enzimatica, il
differenziamento e la proliferazione cellulare (Schopfer, Baker et al. 2003; Radi 2004). Il
coinvolgimento dei perossinitriti nei meccanismi di inibizione dei linfociti T da parte delle MDSC
indotte da tumore è stato inizialmente dimostrato da Kusmartsev e colleghi (Kusmartsev, Li et al.
2000). I perossinitriti, agendo extracellularmente, possono indurre apoptosi in linfociti T umani,
con linfociti T attivati più suscettibili di quelli “resting” a questo effetto, mediante l’inibizione
della fosforilazione di importanti proteine di segnalazione mediante la nitrazione di residui
tirosinici (Brito, Naviliat et al. 1999). Recentemente, è stato dimostrato che i perossinitriti
possono alterare il riconoscimento del complesso MHC I-peptide da parte del TCR, mediante
nitrazione di tirosine nel recettore (Nagaraj, Gupta et al. 2007). Uno studio su linfociti T
infiltranti il tumore (TIL) di adenocarcinoma prostatico umano ha inoltre dimostrato che queste
cellule, che non rispondono a molti stimoli, hanno alti livelli di residui tirosinici nitrati. L’epitelio
prostatico neoplastico, ma non quello normale, sovraesprime ARG e NOS e il contenuto di
nitrotirosine dei TIL viene diminuito dall’impiego di inibitori dei due enzimi in combinazione,
consentendo anche un recupero funzionale di questi linfociti (Bronte and Zanovello 2005).
Queste evidenze indicano che ARG e NOS potrebbero rappresentare un importante meccanismo
mediante cui il tumore induce immunosoppressione in situ e che la ricostituzione della
responsività dei TIL potrebbe essere raggiunta mediante la simultanea inibizione dei due enzimi.
In seguito alla rapida interazione di O2- con altre molecole reattive, le MDSC producono anche
elevate quantità di ROS, come il perossido di idrogeno (Bronte, Serafini et al. 2003; Kusmartsev
and Gabrilovich 2003) (Kusmartsev, Nefedova et al. 2004), che agisce da messaggero cellulare
grazie alla sua capacità di diffondere attraverso le membrane. In animali portatori di tumore i
ROS agiscono sia inibendo la maturazione di cellule dendritiche a favore dell’accumulo di MDSC
(Kusmartsev and Gabrilovich 2003), che sopprimendo l’azione di linfociti T in modo arginasidipendente. L’interazione linfocita-MDSC in presenza dell’antigene aumenta la produzione di
ROS da parte delle cellule mielodi, con meccanismo indipendente da IFN-γ e probabilmente
18
mediato da integrine (CD11b, CD18 e CD29), dato che il blocco con anticorpi specifici di queste
molecole elimina la produzione di ROS e la soppressione dei linfociti T (Kusmartsev, Nefedova
et al. 2004).
Probabile target dei ROS è, ancora una volta, la catena CD3ζ dei linfociti T. È stato già
dimostrato come lo stress ossidativo provocato dalle MSC possa ridurre l’espressione di CD3ζ in
topi portatori di tumore (Otsuji, Kimura et al. 1996). Inoltre, in pazienti con stadi avanzati di
cancro di diverso tipo, si nota in circolo una popolazione espansa di granulociti a bassa densità
che producono H2O2, causando diminuzione di CD3ζ, minor produzione di citochine e
soppressione dei linfociti T (Schmielau, Nalesnik et al. 2001).
Figura 3. Effetti inibitori del metabolismo della L-Arginina delle MDSC su linfociti T attivati.
L-Arg entra nelle MDSC attraverso il trasportatore degli amminoacidi cationici (CAT-2B) ed è prevalentemente
metabolizzata dagli enzimi NOS2 e ARG1, anche se non può essere escluso il contributo di altre isoforme. A
seconda dell’equilibrio tra i due enzimi, possono seguire deplezione di L-Arg extracellulare, rilascio di NO e
produzione di ROS e RNOS (O2-, H2O2, ONOO-). I linfociti T che vengono attivati in un microambiente
condizionato dalle MDSC smettono di proliferare e possono morire per apoptosi mediante vie che coinvolgono
attivazione di GCN2 e sGC, nitrazione di tirosine o nitrosilazione di cisteine in proteine essenziali, perdita di CD3ζ e
interferenza con il signaling del IL-2R. cEBP-β, CCAAT enhancer-binding protein β; MSP, macrophage- stimulation
protein. Figura tratta e modificata da Sica et al. (2008) “Alterated macrophage bdifferentiation and immune
dysfunction in tumor development”. J.Clin.Invest.
19
Le MDSC agiscono solo se esiste un contatto diretto con i linfociti T che vengono inibiti e
questo potrebbe rendere conto da una parte dell’impiego di meccanismi a breve raggio d’azione,
quali la diffusione di ROS e RNOS attraverso le membrane cellulari, dall’altra delle evidenze del
coinvolgimento nei meccanismi di soppressione di proteine di membrana, quali ad esempio
CD80 (Yang, Cai et al. 2006) o CD40 (Pan, Ma et al.).
Alcune osservazioni riportano poi il rilascio di citochine come uno dei possibili meccanismi di
azione di queste cellule soppressorie. Le MDSC possono perturbare la risposta immune
indirizzandola verso un fenotipo pro-tumorale di tipo Th2, ad esempio mediante la produzione di
IL-10, che induce una riduzione della secrezione di IL-12 da parte di macrofagi associati al
tumore (Sinha, Clements et al. 2007). In un diverso modello tumorale, invece, le MDSC vengono
indotte da IL-13 a rilasciare TGF-β, con soppressione dell’attività dei linfociti CTL (Terabe,
Matsui et al. 2003; Fichtner-Feigl, Terabe et al. 2008).
Nonostante la maggior parte degli studi sulle MDSC sia relativa allo studio della risposta
linfocitaria CD8+, queste cellule agiscono anche inibendo l’attività di altri effettori immuni, quali
linfociti T CD4+ (Sinha, Clements et al. 2005), cellule natural killer (NK) (Suzuki, Kapoor et al.
2005; Liu, Yu et al. 2007; Hoechst, Voigtlaender et al. 2009; Li, Han et al. 2009) e cellule T
natural killer (NKT) (Yanagisawa, Exley et al. 2006).
Infine, un meccanismo indiretto tramite cui le MDSC promuovono la crescita tumorale è
l’interazione con altre cellule regolatorie del microambiente tumorale, quali linfociti T regolatori
(Treg) o macrofagi associati al tumore. In un modello murino di colon carcinoma, le MDSC
inibiscono i linfociti T effettori e, al contrario, mediano l’espansione di Treg con un meccanismo
dipendente da IFN-γ che coinvolge il rilascio di TGF-β e IL-10 da parte delle MDSC (Huang,
Pan et al. 2006). Lo stesso gruppo ha poi dimostrato che l’attivazione da parte di IFN-γ comporta
anche un aumento della molecola CD40 sulle MDSC, cruciale per l’induzione di
immunosoppressione e per l’attivazione di Treg (Pan, Ma et al.). In un modello di carcinoma
ovarico, invece, le MDSC cooperano con cellule Treg mediante interazione tra i recettori CD80 e
CD152 per inibire l’attivazione dei linfociti T effettori (Yang, Cai et al. 2006). Recentemente è
stato anche proposto un meccanismo di induzione antigene-specifico dei Treg mediato dalle
MDSC e dipendente da arginasi (Serafini, Mgebroff et al. 2008). L’induzione di Treg da parte di
MDSC è stata anche verificata nell’uomo, in pazienti con epatocarcinoma (Hoechst, Ormandy et
al. 2008).
Le MDSC, come già citato, possono anche interagire con i macrofagi associati al tumore,
riducendone le proprietà citotossiche anti-tumorali, quali il rilascio di IL-12 (Sinha, Clements et
al. 2007). Questi due tipi cellulari condividono molte caratteristiche, dai fattori che ne inducono il
20
reclutamento, al profilo di espressione genica prevalentemente M2 con geni indotti da IFN-γ
(tipicamente M1), alle citochine prodotte, alle funzioni pro-tumorali di immunoregolazione,
induzione di angiogenesi e metastasi. Alcune evidenze suggeriscono che le MDSC possano
differenziare in macrofagi soppressivi (Kusmartsev and Gabrilovich 2005; Van Ginderachter,
Meerschaut et al. 2006) e che possano costituire un continuum di uno stesso programma
differenziativo mieloide indotto da fattori rilasciati dal tumore (Sica and Bronte 2007).
Fenotipo e sottopolazioni delle MDSC murine
La popolazione MDSC, come precedentemente affermato, è eterogenea e comprende cellule
mieloidi diverse a stadi maturativi differenti. Oltre ai marcatori CD11b e Gr-1, in topo hanno
inoltre un fenotipo, generalmente condiviso, F4/80intCD11clowMHC IIlow. Molti studi negli ultimi
anni hanno tentato di chiarire quale porzione delle MDSC sia effettivamente responsabile
dell’azione inibitoria nei confronti dei linfociti T. La composizione di queste cellule mieloidi varia
da tumore a tumore, ed è fortemente dipendente dall’insieme di fattori rilasciati dalle cellule
cancerose, fattori che a loro volta dipendono dall’istotipo tumorale, dalla localizzazione
anatomica e dalle dimensioni della massa neoplastica. Alcuni marcatori sono stati proposti per
l’identificazione di una frazione soppressiva all’interno della macropopolazione MDSC, come la
catena α del recettore per IL-4 e IL-13 (IL-4Rα) (Gallina, Dolcetti et al. 2006), il recettore per
l’M-CSF (Huang, Pan et al. 2006), o la molecola costimolatoria CD80 (Yang, Cai et al. 2006);
queste molecole, però, sono risultate strettamente correlate al modello tumorale analizzato,
rendendole poco adatte ad essere utilizzate come marker generali delle MDSC. Questi studi
hanno fatto strada ad altri, più recenti, che hanno individuato due principali sottopopolazioni di
MDSC, una granulocitaria e una monocitaria, con diverse proprietà immunoregolatorie. E’ stato
infatti osservato da molti gruppi come l’anticorpo anti-Gr-1, comunemente usato per studiare
queste cellule, permetta di distinguere almeno due frazioni cellulari in base alla sua intensità di
espressione, una che esprime il marcatore ad alta intensità (Gr-1high), prevalentemente costituita da
granulociti maturi e immaturi, e una a minor espressione (Gr-1int/low), composta da monociti e
altre cellule mieloidi immature (Terabe, Matsui et al. 2003; Gallina, Dolcetti et al. 2006; Van
Ginderachter, Meerschaut et al. 2006; Fichtner-Feigl, Terabe et al. 2008). L’anticorpo anti-Gr-1
riconosce, con diversa specificità, due molecole della famiglia genica Ly6, Ly6G e Ly6C, che
marcano preferenzialmente cellule granulocitarie e monocitarie, rispettivamente (Fleming,
Fleming et al. 1993; Nagendra and Schlueter 2004; Sunderkotter, Nikolic et al. 2004). Negli ultimi
due anni diversi gruppi hanno fisicamente isolato MDSC dalla milza di topi portatori di tumore
sulla base dell’espressione di queste due molecole, ottenendo due frazioni denominate PMN-
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MDSC (MDSC polimorfonucleate) e MO-MDSC (MDSC mononucleate) (Movahedi, Guilliams
et al. 2008; Youn, Nagaraj et al. 2008). Le PMN-MDSC sono descritte come cellule CD11b+Gr1highLy6G+Ly6Clow/int e sono in grado di sopprimere la risposta linfocitaria secondo entrambi i
gruppi. A seconda dei modelli tumorali impiegati, la soppressione è attribuita in un caso
principalmente alla produzione di specie reattive dell’ossigeno (Youn, Nagaraj et al. 2008),
nell’altro ad un meccanismo IFN-γ-dipendente, ma STAT1-indipendente, che non è mediato da
arginasi, ossido nitrico sintetasi o ROS (Movahedi, Guilliams et al. 2008). Le MO-MDSC, invece,
sono indicate come CD11b+Gr-1intLy6G-Ly6Chigh e, almeno in alcuni modelli, esprimono
marcatori monocitari, quali F4/80, CD115, 7/4 e CCR2, a livelli superiori rispetto alla
controparte polimorfonucleata. Il meccanismo di soppressione di questa sottopopolazione è
mediato da NOS e, almeno parzialmente, IFN-γ-dipendente (Movahedi, Guilliams et al. 2008;
Youn, Nagaraj et al. 2008).
Nuovi studi hanno però riesaminato il ruolo relativo di queste frazioni cellulari, utilizzando un
criterio di separazione basato sull’intensità di espressione dell’anticorpo anti-Gr-1. In due diversi
modelli, uno infiammatorio e uno tumorale, e con metodi di isolamento distinti, uno
citofluorimetrico (Greifenberg, Ribechini et al. 2009) e uno immunomagnetico (in parte
presentato in questa tesi, (Dolcetti, Peranzoni et al. 2009)), è possibile suddividere la popolazione
MDSC in almeno tre frazioni, Gr-1high, Gr-1int e Gr-1low con caratteristiche fenotipiche e
funzionali peculiari. Nonostante le diverse condizioni sperimentali dei due lavori, la popolazione
Gr-1high, costituita prevalentemente da granulociti Ly6Ghigh, ha un debole effetto soppressivo sulla
risposta T antigene-specifica o allogenica. Al contrario, le frazioni Gr-1int e Gr-1low, composte per
la gran parte da cellule mieloidi immature con nucleo ad anello e monociti, rispettivamente, sono
responsabili dell’inibizione linfocitaria in entrambi i modelli (Dolcetti, Peranzoni et al. 2009;
Greifenberg, Ribechini et al. 2009) . Un contributo indiretto alla soppressione da parte della
sottopopolazione Gr-1high non può essere escluso, dal momento che queste cellule rilasciano IFNγ e sono in grado di sopprimere la risposta CTL quando sono presenti in vitro in percentuali
elevate, superiori al 30% della coltura linfocitaria, mediante un meccansimo ROS- e NO-mediato
(Dolcetti, Peranzoni et al. 2009).
Una simile distinzione tra frazioni mononucleate e polimorfonucleate è descritta anche per
MDSC infiltranti il tumore. In due diversi modelli tumorali, le MDSC sono risultate al 90%
costituite da monociti CD11b+Gr-1lowF4/80+IL-4Ra+CCR2+CX3CR1+ con marker sia di
macrofagi M1 che M2, e per il resto da cellule Gr-1highF4/80low (Umemura, Saio et al. 2008). In un
altro lavoro, la componente polimorfonucleata viene reclutata al sito tumorale dal frammento
22
C5a del complemento, mentre quella mononucleata non risente di questo effetto ma è indotta
dalla stessa molecola a produrre ROS e RNS (Markiewski, DeAngelis et al. 2008).
Le MDSC nell'uomo
Le MDSC sono state descritte nell’uomo, ma il loro fenotipo è meno definito e probabilmente
dipende dall'istotipo tumorale in maniera maggiore rispetto a quanto avviene nei modelli murini.
La presenza di MDSC è documentata a livello del sangue e dell’infiltrato. Nonostante manchi
nell’uomo un analogo del marcatore Gr-1 murino, anche in questo caso ci sono evidenze
dell’esistenza di frazioni granulocitarie e monocitarie con proprietà funzionali simile.
Inizialmente, MDSC provenienti dal sangue di pazienti con carcinoma della testa e del collo,
carcinoma polmonare non a piccole cellule e carcinoma del seno sono state descritte come
monociti e cellule dendritiche immaturi, cellule mieloidi a stadi differenziativi più precoci, e una
bassa percentuale di progenitori ematopoietici (Almand, Clark et al. 2001). Queste cellule
inibiscono risposte T allogeniche e antigene-specifiche e, in maniera simile a quanto avviene per
le MDSC murine, possono differenziare in DC mature in presenza della combinazione di GMCSF e IL-4 o di acido trans-retinoico (Almand, Clark et al. 2001; Kusmartsev, Cheng et al. 2003).
Più recentemente, una popolazione altamente soppressiva è stata riscontrata in pazienti con
melanoma mestastatico. Queste cellule, con fenotipo CD14+HLA-DR-/low, non rilevabili in
soggetti sani, utilizzano un meccanismo di soppressione mediato da TGF-β indipendente da
arginasi e NOS e vengono ulteriormente espanse dalla somministrazione di vaccini con GM-CSF
(Filipazzi, Valenti et al. 2007). Inoltre, MDSC con simile fenotipo monocitario sono state
identificate in pazienti con carcinoma prostatico (Vuk-Pavlovic, Bulur et al. 2009), con mieloma
multiplo e carcinoma della testa e del collo (Serafini, Meckel et al. 2006). L’espansione di una
popolazione CD14+HLA-DR-/low è stata riscontrata anche nel sangue periferico di pazienti con
epatocarcinoma, dove sono in grado di sopprimere la proliferazione linfocitaria mediante arginasi
e di indurre una popolazione di Treg (Hoechst, Ormandy et al. 2008).
Una delle prime evidenze di una popolazione MDSC con fenotipo granulocitario
CD11b+CD15+CD14-, esprimenti arginasi, deriva dallo studio di pazienti con carcinoma renale
(Zea, Rodriguez et al. 2005). Lo stesso gruppo ha successivamente descritto queste cellule come
granulociti attivati CD66b+VEGFR1+CD62LlowCD16low che rilasciano arginasi 1 in circolo in
seguito a degranulazione (Rodriguez, Ernstoff et al. 2009). In pazienti con melanoma o
carcinoma del colon, il marcatore IL-4Rα+, che caratterizza le MDSC in alcuni modelli tumorali
murini, è espresso da due popolazioni MDSC umane, una monocitaria e una granulocitaria, ma la
23
sua espressione correla con l’attività soppressoria solo nella frazione CD14+(Mandruzzato, Solito
et al. 2009).
Come inizialmente riportato nei primi studi sulle MDSC umane, queste cellule comprendono
spesso elementi cellulari immaturi (Almand, Clark et al. 2001). In pazienti con carcinoma renale,
per esempio, le MDSC possono essere isolate dal sangue periferico nella frazione Lin-/HLA-DR-,
che comprende cellule con fenotipo sia monocitario che granulocitario, che agiscono con
meccanismo regolato da ROS e NO e possono essere differenziate in vitro, perdendo la loro
attività soppressiva, tramite acido trans-retinoico (ATRA) (Kusmartsev, Su et al. 2008). In un altro
studio su pazienti con carcinoma mammario, il numero di cellule Lin-/HLA-DR-CD11b+CD33+
correla con lo stadio della neoplasia e l’estensione delle metastasi (Diaz-Montero, Salem et al.
2009).
24
Meccanismi di espansione delle MDSC
La regolazione del programma di differenziamento mieloide a partire dai precursori è sottoposto
ad un controllo genico fine dei livelli di appropriati fattori trascrizionali e dell’arresto del ciclo
cellulare. Le cellule staminali ematopoietiche pluripotenti (HSC) possono quindi dare origine a
granulociti e monociti maturi attraverso un fitto network di fattori di trascrizione finemente
regolati come proposto nello schema riportato in figura (Friedman 2002). L’alterazione quindi
delle vie di trascrizioni del segnale, determinata da condizioni di stimolazione immune acuta e
cronica, può portare ad un alterato differenziamento mieloide che può avvenire a differenti stadi
maturativi.
Figura 4. Modello per la regolazione trascrizionale del differenziamento dei monociti e dei neutrofili.
Il differenziamento delle cellule staminali pluripotenti (HSC) nei due principali lineage mieloidi, il lineage monocitario
ed il lineage neutrofilico è orchestrato da una rete gerarchica finemente regolata di fattori di trascrizione. I singoli
fattori sono essenziali per specifici step. RUNX1 (Runt-related transcription factor 1) ed SCL ( stem cell leukaemia
factor) sono richiesti per la generazione di HSC fetali ( haematopoietic stem cell) dal mesoderma, mentre GFI1
(growth factor independent 1) e C/EBPα (CCAAT/enhancer binding protein α) agiscono in maniera autocina
rigenerando HSC da quelle già esistenti. Mentre C/EBPα ha un ulteriore ruolo indispensabile nel nel mediare la
transizione da CMP (common myeloid progenitors) verso i GMP (granulocyte/monocyte progenitor), GFI1 e
C/EBPε sono cruciali per gli stadi terminali della produzione dei neutrofili. La produzione dei macrofagi dipende da
PU.1 e IRF8 (interferon –regulatory factor 8). In questo processo, PU.1 sembra essere essenziale per tutti gli stadi
intermedi partendo dalle HSC , mentre IRF8 sembra intervenire sui progenitori tardivi. Figura tratta e modificata da
Rosenbauer et al. (2007) “Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with
transformation”. Nat Rev Immunol.
25
Numerosi fattori trascrizionali potrebbero essere studiati per un loro possibile coinvolgimento
nell’induzione di MDSC. Particolarmente interessanti appaiono quelli attivati in maniera
preferenziale durante la mielopoiesi di emergenza che si ha in seguito a stimoli infiammatori
cronici. Tra questi la famiglia di fattori di trascrizione CCAAT enhancer-binding proteins
(C/EBP) comprende proteine con una regione C-terminale avente tipica struttura a cerniera di
leucine adiacente ad un classico dominio che lega il DNA. Le regioni N-terminali sono invece
più variabili e contengono domini di attivazione trascrizionale. Nel sistema ematopoietico,
l’espressione delle proteine C/EBP è limitata al “lineage” mieloide e distinti membri della famiglia
hanno funzioni differenti nello sviluppo dei macrofagi e dei granulociti (Valledor, Borras et al.
1998). Recentemente è stato dimostrato che C/EBPα, espresso principalmente dalle cellule
mieloidi pluripotenti indifferenziate, decresce gradualmente con la maturazione macrofagica ed è
richiesto per regolare la granulopoiesi soltanto in condizioni steady-steate. C/EBPβ invece è upregolato durante la maturazione macrofagica ed interviene nella granulopoiesi di emergenza in
relazione a stimoli esterni come le infezioni e all’esposizione di fattori di crescita, inducendo un
incremento nella produzione di granulociti, inibendo l’apoptosi e inducendo la produzione di
citochine quali IL-6, IL-10 ed IL-12 (Valledor, Borras et al. 1998; Hirai, Zhang et al. 2006).
Alcune evidenze inoltre suggeriscono una possibile relazione e regolazione reciproca tra C/EBPβ
e STAT3 anche nelle MDSC poiché è stato già dimostrato il ruolo di C/EBPβ come coattivatore
nell’attività trascrizionale di STAT3 ad esempio in cellule di epatocarcinoma umano (He, Zhu et
al. 2006).
Figura 5 . Ruolo di C/EBPβ nella granulopoiesi e nella funzione dei granulociti.
C/EBPα è richiesto nella granulopoiesi nelle condizioni “steady-state”. In risposta a stimoli esterni, come infezioni
acute e l’esposizione a fattori di crescita, C/EBPβ incrementa la produzione di granulociti, inibisce l’apoptosi e
induce la produzione di IL-6, IL-12, IL-10 e p35. Figura tratta e modificata da Carsten Muller et al.(2008) “The idden
faces of C/EBPβ”. Blood.
26
L’espansione e l’attivazione delle MDSC è promossa da differenti fattori che possono essere
divisi in due gruppi principali. Il primo gruppo include i fattori che sono rilasciati dal tumore
(tumor-derived soluble factors, TDSF) i quali promuovono l’espansione delle MDSC attraverso la
stimolazione della mielopoiesi e l’inibizione della differenziazione di cellule mieloidi mature. Il
secondo gruppo di fattori è prodotto principalmente dai linfociti T attivati e dalle cellule stromali
del tumore e sono implicati direttamente nell’attivazione delle MDSC.
I TDSF comprendono diverse molecole biologicamente attive, tra cui fattori di crescita, citochine
e chemochine, alcune comuni a diversi tumori, altre caratteristiche di determinate neoplasie; al
momento nessuno di questi mediatori si è rivelato sufficiente, da solo, ad indurre completamente
il fenotipo e la funzione di cellule MDSC.
• IL-3 Una delle prime citochine che sono state associate ad un’aumentata mielopoiesi in
animali portatori di tumore e all’induzione di una popolazione mieloide con attività
soppressoria è l’interleuchina 3 (IL-3). Studi iniziali condotti sul modello del tumore
polmonare di Lewis (Lewis lung carcinoma, LLC), infatti, hanno evidenziato come IL-3 e
GM-CSF (granulocyte/macrophage colony stimulating factor) rilasciati dal tumore siano
in grado di indurre MDSC sia in vivo che in vitro su colture di midollo (Young, Young et al.
1990; Young, Wright et al. 1991).
• GM-CSF Studi sul ruolo della produzione tumorale di GM-CSF, rilasciato
spontaneamente dal 31% dei tumori umani e da diverse linee murine, sul reclutamento e
la maturazione delle APC, hanno permesso di osservare che questa citochina, da sola, è in
grado di indurre la popolazione soppressoria CD11b+Gr-1+, a differenza di quanto
avviene in presenza di tumori non secernenti GM-CSF. Quest’azione di reclutamento
delle MDSC e l’immunosoppressione ad esse associata si ottengono anche con la
semplice somministrazione di GM-CSF ricombinante in topo (Bronte, Chappell et al.
1999). Nell’uomo, studi su pazienti con carcinoma squamoso della testa e del collo hanno
individuato quali fattori prognostici negativi la quantità di GM-CSF rilasciato dal tumore e
il numero di cellule CD34+ infiltranti la massa tumorale primaria. I pazienti con tumori
che producevano alte quantità di GM-CSF o avevano alto contenuto di CD34+
mostravano un’incidenza estremamente elevata di recidiva e metastasi, mentre la
maggioranza dei pazienti con basso rilascio di GM-CSF o basso numero di CD34+
rimaneva libera da malattia (Young, Wright et al. 1997).
Queste scoperte sono in apparente contrasto con la moltitudine di dati sperimentali che
provano che cellule tumorali modificate geneticamente per produrre GM-CSF sono
27
potenti vaccini antitumorali in modelli pre-clinici. Infatti, tumori γ-irradiati ingegnerizzati
per rilasciare questa citochina sono impiegati per reclutare ed espandere APC
professionali, che presentino gli antigeni rilasciati dalle cellule tumorali in via di
degenerazione ai linfociti infiltranti il tumore, con lo scopo di attivare la risposta immune
antitumorale (Jaffee, Lazenby et al. 1995; Dranoff 2002). Da questi dati sembra emergere
una complessa relazione dose-risposta tra le varie funzioni e la quantità di GM-CSF
somministrata. Alte dosi potrebbero attivare i macrofagi e, possibilmente, altre cellule
mieloidi a rilasciare fattori immunosoppressivi, mentre questi effetti potrebbero non
essere così evidenti alle basse dosi. In alternativa, solamente alte dosi potrebbero
mobilizzare abbastanza precursori mieloidi immaturi con azione immunosoppressiva.
Studi recenti su vaccini antitumorali con GM-CSF, in cui si è mantenuta costante la dose
di antigene variando quella di GM-CSF, hanno dimostrato l’esistenza di un livello-soglia
sistemico per questa citochina, oltre il quale si perde l’efficacia del vaccino e si determina
immunosoppressione in vivo, mediante il reclutamento di MDSC (Serafini, Carbley et al.
2004). Nel lavoro di Filipazzi e colleghi, è riportata l’espansione di MDSC con fenotipo
monocitario CD14+HLA-DR–/lo, in grado di inibire la proliferazione linfocitaria tramite
rilascio di TGF-β, anche in pazienti con melanoma sottoposti a vaccinazione
antitumorale con GM-CSF a bassa dose, che correla con una scarsa risposta
immunologica al vaccino (Filipazzi, Valenti et al. 2007). L’utilizzo di cellule tumorali
irradiate come vaccini può perciò favorire la risposta immunitaria mediante, da un lato, il
rilascio locale e probabilmente di breve durata del GM-CSF, e dall’altro, la maturazione e
l’attivazione di APC grazie alla morte apoptotica delle cellule. Se però lo stimolo della
risposta antitumorale è scarso e la concentrazione di GM-CSF diventa consistente a
livello sistemico (il livello soglia può variare tra neoplasie diverse a causa di fattori
rilasciati dal tumore già presenti in circolo), si può avere mobilizzazione di precursori
mieloidi dal midollo osseo che causano un accumulo di MDSC nel sangue e negli organi
linfoidi con conseguente inibizione della citotossicità antitumorale.
• VEGF Il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) è secreto dalla maggior parte
dei tumori ed alti livelli sono associati ad una prognosi negativa. Questo fattore di
crescita, somministrato in vivo agisce inibendo il differenziamento delle cellule dendritiche
e provocando un parallelo accumulo di cellule mieloidi immature Gr-1+ (Gabrilovich,
Chen et al. 1996; Gabrilovich, Ishida et al. 1998). In un modello di carcinoma mammario
simile a quello umano, la progressione neoplastica correla con il livello ematico di VEGF,
28
responsabile dell’accumulo di MDSC nel sangue e nella milza (Melani, Chiodoni et al.
2003). L’utilizzo di amino-bifosfonati come inibitori della metalloproteasi 9 (MMP-9), che
regola la biodisponibilità di VEGF, permette di ridurre l’accumulo di MDSC e di
ripristinare la risposta immune antitumorale indotta da immunizzazione nello stesso
modello tumorale (Melani, Sangaletti et al. 2007). Un altro studio ha dimostrato come
l’attivazione del recettore VEGFR2 sia in grado di indurre l’espansione di cellule mieloidi
nel midollo osseo, tramite aumento diretto o indiretto dei livelli di GM-CSF (Larrivee,
Pollet et al. 2005).
• SCF Un altro fattore che si è rivelato importante nel reclutamento di MDSC è lo stem cell
factor (SCF, ligando di c-kit): il silenziamento di questa proteina in cellule tumorali o la
sua neutralizzazione con anticorpi specifici in vivo è infatti in grado, oltre che di ridurre il
numero di cellule CD11b+Gr-1+CD115+ nel midollo osseo degli animali portatori di
tumore, di rallentare la crescita tumorale e l’angiogenesi, ristabilire la proliferazione di
linfociti T in vitro e di aumentare l’efficacia di un trattamento immunoterapeutico in vivo
(Pan, Wang et al. 2008). L’importanza di questo fattore è confermata dall’osservazione
che l’assenza di MMP-9, che ne regola il rilascio in forma solubile, è associata ad una
marcata riduzione nel reclutamento di MDSC (Yang, Huang et al. 2008).
• PGE2/COX2 Uno dei fattori che negli ultimi anni è stato studiato come responsabile
dell’accumulo e dell’attivazione di MDSC è la prostaglandina E2 (PGE2), prodotta
dall’enzima cicloossigenasi 2 (COX2) a partire dall’ acido arachidonico. Nel topo, questo
mediatore infiammatorio sembra cruciale, almeno in alcuni modelli tumorali, per
l’accumulo di MDSC. In vitro, il signalling dei recettori per PGE2, EP1, EP2 e EP4 è
coinvolto nell’espansione di MDSC a scapito di cellule dendritiche. Animali knock-out
per il recettore EP2 dimostrano una crescita tumorale rallentata, un minor accumulo di
MDSC a parità di dimensioni tumorali e una ridotta capacità soppressiva di queste cellule.
Lo stesso effetto viene inoltre riprodotto in vivo, in animali wild type, dalla
somministrazione di un inibitore di COX2 (Sinha, Clements et al. 2007). In un altro
modello tumorale murino, Rodriguez e colleghi hanno verificato come PGE2 prodotta
dalle cellule tumorali sia in grado, principalmente attraverso il recettore EP4, di indurre
l’enzima arginasi 1 nelle MDSC infiltranti il tumore (Rodriguez, Hernandez et al. 2005).
L’inibitore di COX2 Celecoxib, in modo simile, oltre a ridurre l’accumulo di MDSC in un
tumore indotto da carcinogenesi chimica, è in grado di normalizzare i livelli di espressione
29
degli enzimi Arg1 e Nos2 nella milza degli animali trattati (Talmadge, Hood et al. 2007).
Recentemente, la produzione di PGE2 da parte di cellule tumorali, con conseguente
accumulo di MDSC, è stata correlata al signalling innescato dall’interazione tra la
molecola Fas e il suo ligando FasL (Zhang, Liu et al. 2009).
• IL-1β/IL-6/M-CSF Un altro mediatore infiammatorio che si è dimostrato in grado di
causare l’espansione di MDSC in diversi modelli tumorali è l’interleuchina-1 (IL-1) (Song,
Krelin et al. 2005; Bunt, Sinha et al. 2006; Bunt, Yang et al. 2007). L’azione di questa
citochina, che sembra agire sull’induzione ma non sull’attivazione delle MDSC, è indiretta
e mediata da IL-6 e, probabilmente, da PGE2, GM-CSF e M-CSF (macrophage-colony
stimulating factor) (Dinarello 1996). IL-6 e M-CSF potrebbero influenzare il
differenziamento delle MDSC dato che è nota la loro capacità di inibire la maturazione di
cellule dendritiche (DC) (Menetrier-Caux, Montmain et al. 1998), mediata, almeno
parzialmente, da STAT3 (Park, Wiekowski et al. 2006). L’attivazione di questo fattore di
trascrizione sembra infatti cruciale per la regolazione dell’espansione di MDSC sia in vitro
che in vivo (Nefedova, Huang et al. 2004; Kortylewski, Kujawski et al. 2005; Nefedova,
Nagaraj et al. 2005); inoltre, recenti evidenze sottolineano l’importanza dell’attivazione di
STAT3 nelle MDSC nell’induzione di angiogenesi (Kujawski, Kortylewski et al. 2008).
• S100A8/S100A9 Le proteine pro-infiammatorie S100A8/S100A9 sono sovra-espresse in
cellule che infiltrano molti tumori epiteliali e contribuiscono ad amplificare
l’infiammazione al sito tumorale grazie alle loro proprietà chemo-attraenti nei confronti
dei leucociti (Ryckman, Vandal et al. 2003),. Recentemente è stato dimostrato come in
animali portatori di tumore questi mediatori siano coinvolti in un circuito di
autoregolazione delle MDSC, da cui vengono prodotti e utilizzati come fattore autocrino
di reclutamento al sito tumorale, garantendo perciò il mantenimento di un microambiente
immunosoppressivo (Sinha, Okoro et al. 2008). STAT3 sembra responsabile dell’aumento
di S100A8/S100A9, che agiscono impedendo la completa maturazione delle MDSC
mediante l’incremento di ROS (Cheng, Corzo et al. 2008).
• CCL2 E’una delle principali chemochine presenti nel microambiente tumorale è nota per
il suo ruolo chemotattico nei confronti di macrofagi, che possono favorire l’angiogenesi e
la metastasi (Soria and Ben-Baruch 2008). La sua capacità pro-tumorale sembra dovuta
anche al reclutamento di MDSC, che in sinergia con l’azione dei macrofagi, favoriscono la
30
diffusione neoplastica (Huang, Lei et al. 2007). Questa chemochina sembra far parte di un
circuito di reciproca attivazione con IL-6 in cellule CD11b+ isolate dal sangue periferico
di pazienti con carcinoma metastatico della prostata: le due molecole proteggono queste
cellule dall’apoptosi inducendo proteine anti-apoptotiche e inducono un fenotipo simile a
quello di macrofagi M2 alternativamente attivati (Roca, Varsos et al. 2009).
Molti dei fattori rilasciati dal tumore, anche qui sopra riportati, attivano nelle MDSC vie di
segnalazione che convergono verso i membri della famiglia di proteine JAK (“Janus Kinase”) ed
il fattore trascrizionale STAT3 (“Transducer and activator of transcription 3”) che sono molecole
di
segnalazione
coinvolte
nella
soppravvivenza
cellulare,
nella
proliferazione,
nel
differenziamento e nell’apoptosi. Ad oggi STAT3 è stato dimostrato essere il principale fattore
che regola l’espansione delle MDSC (vedi Fig.6). Nelle MDSC isolate da topi portatori di tumore,
rispetto a quelle isolate da topi sani i livelli di espressione di STAT3 sono molto più elevati
(Nefedova, Nagaraj et al. 2005). L’esposizione delle cellule ematopoietiche progenitrici ai
surnatanti provenienti dalle colture delle cellule tumorali induceva l’attivazione di JAK2 e STAT3
ed era associato con l’espansione delle MDSC in vitro . L’espansione era limitata quando
l’espressione di STAT3 nelle cellule ematopoietiche era inibita (Nefedova, Huang et al. 2004)
inoltre l’eliminazione dell’espressione di STAT3 attraverso l’uso di topi knockout condizionali o
l’uso di inibitori selettivi per STAT3 riduceva marcatamente l’espansione delle MDSC ed
aumentava la risposta dei linfociti T nei topi portatori di tumore (Kortylewski, Kujawski et al.
2005; Nefedova, Nagaraj et al. 2005). L’attivazione di STAT3 è associata con aumento della
sopravvivenza e proliferazione dei progenitori midollari probabilmente attraverso l’espressione di
ciclina D1, MYC e survivina. Quindi l’attivazione anomala e persistente di STAT3 nei progenitori
mieloidi previene il loro differenziamento in cellule mieloidi mature e perciò promuove
l’espansione delle MDSC (Foell, Wittkowski et al. 2007). Alcune evidenze inoltre suggeriscono
una possibile relazione e regolazione reciproca tra C/EBPβ e STAT3 anche nelle MDSC poiché è
stato già dimostrato il ruolo di C/EBPβ come coattivatore nell’attività trascrizionale di STAT3 ad
esempio in cellule di epatocarcinoma umano (He, Zhu et al. 2006).
Meccanismi di attivazione
Ci sono opinioni discordanti sulla capacità soppressiva di cellule CD11b+Gr-1+ isolate da animali
sani; a meno di non arricchire sottotipi cellulari normalmente presenti in percentuali ridotte, se si
considerano le macropopolazioni CD11b+ o Gr-1+ non si osserva generalmente inibizione della
risposta immune in vitro, se non a concentrazioni molto elevate (Kusmartsev, Nefedova et al.
2004; Sinha, Clements et al. 2005; Yang, Cai et al. 2006; Dolcetti, Peranzoni et al. 2009). Questo
31
induce a pensare che fattori rilasciati dal tumore o da altre cellule del microambiente siano
necessari, oltre che per il reclutamento di MDSC, anche per attivare in queste cellule un
programma soppressivo. Nonostante si sappia ancora poco a riguardo, la maggior parte dei
fattori finora identificati sono secreti da linfociti T attivati e cellule stromali in risposta a stimoli
infiammatori, quali infezioni o morte di cellule tumorali, e attivano nelle MDSC una serie di vie di
segnalazione che coinvolgono STAT6, STAT1 e Nf-kB (vedi Fig.6). Il principale mediatore
conosciuto è l’IFN-γ, che attivando principalmente la via di STAT1, è responsabile dell’induzione
della ossido nitrico sintetasi 2 (NOS2) (Kusmartsev and Gabrilovich 2005; Gallina, Dolcetti et al.
2006; Movahedi, Guilliams et al. 2008). In un modello infiammatorio non tumorale, la
combinazione di LPS e IFN-γ aumenta la capacità soppressiva delle MDSC in vitro e genera
tolleranza antigene-specifica in vivo (Greifenberg, Ribechini et al. 2009). Un’altra importante via
molecolare coinvolta nell’attivazione delle MDSC è quella di STAT6, attivata da IL-4 e IL-13
tramite la catena del recettore comune alle due citochine IL-4Rα. L’IL-13 prodotta dalle stesse
cellule soppressorie o da cellule NKT è importante, in alcuni modelli tumorali, per la
polarizzazione delle MDSC verso un fenotipo M2, con induzione di arginasi 1 tramite STAT6 )
(Sinha, Clements et al. 2005; Gallina, Dolcetti et al. 2006), mentre in altri per la forte induzione
del rilascio della citochina immunosoppressiva TGF-β da parte delle MDSC (Terabe, Matsui et al.
2003).
32
Figura 6 . Vie di segnalazione coinvolte nell’espansione delle MDSC. L’accumulo delle MDSC è regolato da
parecchi fattori che sono che sono rilasciati dalle cellule tumorali, stromali del tumore, da cellule T e macrofagi
attivati, da cellule tumorali apoptotiche, agenti batterici e virali, e da cellule infettate da patogeni. Questi fattori
attivano parecchie differenti vie di segnalazione nelle MDSC che coinvolgono principalmente la famiglia dei fattori di
trascrizione STAT (“Signal Transducer and Activator of Transcription”). STAT3 regola l’espansione delle MDSC
stimolando la mielopoiesi ed inibendo il differenziamento delle cellule mieloidi e promuove la sopravvivenza delle
MDSC inducendo l’espressione di MYC, BCL-XL e ciclina D1. Esso contribuisce anche all’incremento nella
produzione di ROS (“Reactive Oxygen Species”) generato dalle MDSC. L’attivazione dei fattori STAT6 e STAT1,
così come l’attivazione del fattore NF- κB (“Nuclear Factor- κB”) mediata dal TLR (“Toll-like receptor”) determina
l’attivazione delle MDSC che porta all’ up-regolazione di arginasi 1 e ossido nitrico sintetasi 2 (iNOS), all’aumentata
produzione di citochine soppressive quali ad esempio il TGFβ. In combinazione con STAT3, STAT1 eSTAT6 esso
contribuisce all’upregolazione della produzione di ROS da parte delle MDSC (non mostrato). S100A8 e S100A9 si
legano direttamente a componenti del complesso NADPH ossidasi. Questo legame potenzia l’attivazione dell’osidasi
NADPH nelle MDSC , il quale determina la produzione di ROS, inducendo quindi gli effetti soppressivi.
Probabilmente l’attivazione delle MDSC attraverso i TLR abbia un importante ruolo durante le infezioni
patogenetiche.
G-CSF,
fattore
stimolante
la
formazione
di
colonie
granulocitarie;
GM-CSF,
CSF
granulocitico/macrofagico; IFNγ, Interferone-γ; IL, interleuchina; JAK, Janus chinasi; M-CSF, CSF macrofagico;
MyD88, gene 88 di risposta della differenziamento mieloide primario; Phox, ossidasi fagocitica; VEGF, fattore di
crescita dell’epitelio vascolare. Figura tratta e modificata da Gabrilovich et al.(2009) “Myeloid-derived suppressor
cells as regulators of the immune system”. Nat Rev Immunology.
33
Immunoterapia dei tumori
I successi ottenuti nell’ambito della vaccinoterapia anti-infettiva hanno di fatto acceso le speranze
che quest’approccio possa sortire effetti altrettanto promettenti anche nell’ambito della terapia
oncologica. La vaccinoterapia come la profilassi delle malattie infettive si propone di
sensibilizzare l’organismo ospite per un eventuale futuro incontro con l’antigene, rappresentato
nella maggior parte dei casi da proteine non-self fortemente immunogeniche. Diversa, invece, la
situazione per ciò che attiene agli approcci vaccinali antineoplastici che, escluse alcune eccezioni,
si propongono in primis di generare una risposta immunitaria terapeutica, ovvero in presenza di
malattia conclamata, nei confronti di antigeni self verso cui verosimilmente esiste uno stato di
tolleranza immunologica. Purtroppo esistono diversi limiti a questo approccio. Esiste una forte
tolleranza centrale e periferica nei confronti degli antigeni tumorali che altro non sono che
proteine self. La tolleranza immunologica è uno dei processi chiave dello sviluppo del sistema
immunitario e si compone di eventi precoci e tardivi, spesso mediati da altri effettori del sistema
immune che proteggono l’organismo da potenziali aggressioni autoimmuni. Nonostante
l'esistenza di questi meccanismi di controllo, dati recenti hanno comunque dimostrato che
esistono antigeni tumore-associati che vengono riconosciuti dalle cellule T. La possibilità che a
condizionare la scarsa efficacia della risposta immune antitumorale non sia l’assenza di antigene
ma la circostanza ambientale e temporale nella quale il sistema immunitario viene a contatto con
il tumore apre per la vaccinoterapia antitumorale promettenti spazi d’intervento.
L’osservazione sperimentale che la risposta immune cellulare era la principale responsabile del
rigetto di tumori trapiantati in topi ed il riscontro che l’infiltrato tumorale fosse costituito
soprattutto da linfociti T ha portato i ricercatori a concentrare la loro attenzione sull’immunità
cellulo-mediata. Il principale meccanismo di immunità tumorale è rappresentato, infatti,
dall’uccisione delle cellule neoplastiche da parte dei linfociti T CD8+. Per schematicità sono stati
distinti due tipi di immunoterapia antitumorale: l’immunoterapia attiva, che ha lo scopo di
potenziare le deboli difese antitumorali dell’ospite in vivo, e l’immunoterapia passiva, che fornisce
al paziente neoplastico anticorpi o linfociti T tumore-specifici (immunoterapia cellulare adottiva),
prodotti in vitro o ex vivo, e trasferiti nell’ospite da trattare solo successivamente.
Immunoterapia passiva: il successo del trasferimento adottivo degli effettori immunitari
CD8+
L’immunoterapia cellulare è il trasferimento in un organismo ospite di cellule immuni con lo
scopo di introdurre nuove funzioni o di correggere quelle difettive. L’entusiasmo riposto in
questo approccio deriva dalla possibilità di manipolare, ex vivo, vie biologiche cellulari e
34
molecolari in un modo che non sarebbe altrimenti possibile nell’ospite “intatto”(Dudley,
Wunderlich et al. 2002). Nell’uomo i primi approcci di trasferimento adottivo, effettuati prima
dell’identificazione di antigeni tumorali, si basavano nel trasferimento di cellule killer attivate da
linfochine (LAK) ricavate dai linfociti del sangue periferico del paziente, coltivate in vitro in
presenza di elevate concentrazioni di IL-2 ed, infine, reinoculate nell’ospite in associazione alla
somministrazione di IL-2 ricombinante per via sistemica e caratterizzate da un'attività citotossica
non HLA-ristretta (Rosenberg, Mule et al. 1985).
L'utilizzo delle cellule LAK, che hanno dato ottimi risultati nei modelli murini, ha generato
nell'uomo risultati molto discutibili. Gli studi successivi si sono quindi indirizzati verso il
trasferimento adottivo di linfociti T CD8+ caratterizzati da un'attività citotossica antigenespecifica ed HLA-ristretta. Recenti osservazioni hanno dimostrato che l'efficacia terapeutica del
trasferimento adottivo cellulare (ACT), sia nei modelli murini che nei trials clinici, è influenzato
dallo stadio maturativo del linfocita T CD8+ (Gattinoni, Klebanoff et al. 2005). La popolazione
dei linfociti T viene suddivisa classicamente in quattro stadi maturativi: CD8+ naïve, CD8+
effettori precoci, CD8+ effettori intermedi e CD8+ effettori tardivi. Tale suddivisone si basa
sull'analisi fenotipica di alcuni CD, sulla lunghezza dei telomeri e sull'espressione genica (Appay,
Dunbar et al. 2002 ; Lanzavecchia and Sallusto 2002). Un aspetto indubbiamente interessante è
legato all'osservazione che i linfociti T CD8+ effettori tardivi, se pur presentano un'ottima attività
citotossica in vitro, risultano avere un debole impatto terapeutico in vivo, di circa 100 volte
inferiore se paragonato a quello dei linfociti T CD8+ effettori intermedi (Sussman, Parihar et al.
2004; Wang, Huang et al. 2004). Una possibile spiegazione di questa diversa funzionalità può
esser dovuta alla perdita del CD62L, una glicoproteina di membrana essenziale per l'homing del
linfocita al linfonodo. L'incapacità del linfocita T di migrare nei linfonodi secondari correla con
l'inefficacia terapeutica degli effettori immunitari ed evidenzia come il microambiente tumorale
non sia grado di attivare da solo i linfociti T CD8+(Kagamu, Touhalisky et al. 1996; Speiser,
Miranda et al. 1997). Tuttavia, l'ACT basata sull'impiego di linfociti T effettori tardivi CD62LCCR7- ha portato ad ottimi risultati terapeutici nei pazienti con melanoma (Dudley, Wunderlich
et al. 2002).
Per incrementare l'efficacia terapeutica dell'ACT sono state sperimentate varie strategie tra le
quali l'utilizzo di adiuvanti per promuovere la funzionalità dei linfociti CD4+ Th1 endogeni,
essenziali per mantenere l'attivazione degli effettori trasfusi (De et al., 2005), la co-infusione di
TIL e linfociti T CD4+ Th1 (Hu et al., 2000), la somministrazione di citochine IL-2, IL-7, IL-12,
IL-15 (Rosenberg et al., 1994; Klebanoff et al., 2005), molecole antagoniste quali per esempio
bloccanti di TGF-β (Suzuki et al., 2004), anticorpi anti-CTLA-4 (Sutmuller et al., 2001), ed
35
anticorpi attivanti la funzionalità dei linfociti T (Grabert et al., 2006). Una menzione speciale va
fatta per la metodica della mielo-linfo-deplezione del paziente tramite radioterapia o
chemioterpia, (Cheever, Greenberg et al. 1980). Il razionale della mielo-linfo-deplezione consiste,
in primo luogo, nell'eliminare le popolazioni linfocitarie endogene che competono per le
citochine omeostatiche del pool linfocitario (IL-7, IL-15 e IL-2) e che, quindi, potrebbero
ostacolare la proliferazione di linfociti T trasferiti (Muranski, Boni et al. 2006). In secondo luogo
l'eliminazione delle popolazioni immuno-regolatorie, sia del comparto linfoide (come i linfociti
Treg CD4+CD25+FOXP3+) che mieloide (come le MDSC), potrebbe favorire l'azione effettrice
delle cellule T trasferite. Inoltre, la mielo-linfo-deplezione è in grado di indurre delle
modificazioni fenotipiche importanti nei linfociti T trasferiti. È stato descritto, infatti, come i
TIL, che normalmente presentano una bassa espressione delle proteine di superficie CD28 e
CD27, dopo trasferimento in pazienti mielo-linfo-depletati, esprimano entro breve tempo, alti
livelli delle due proteine di membrana (Hendriks, Gravestein et al. 2000). L'espressione del CD28
e del CD27, oltre a migliorare l'efficacia citotossica, determina soprattutto un incremento della
sopravvivenza dei TIL trasferiti (Powell, Dudley et al. 2005). Similmente anche la catena α del
recettore per IL-7 (IL-7Rα), normalmente poco espresso a livello della membrana plasmatica dei
TIL, viene iperespressa dopo trasferimento nei pazienti sottoposti a un regime mielo-linfodepletivo (Kaech, Tan et al. 2003; Powell, Dudley et al. 2005). Gli agenti chimici e ionizzanti,
utilizzati per indurre la mielo-linfo-deplezione, sono in grado, inoltre, di modulare
l'immunogenicità delle cellule tumorali stesse, determinando una maggior espressione di molecole
MHC di classe I, e questo, sia nei modelli murini che nei pazienti (Gelbard, Garnett et al. 2006).
L' utilizzo della mielo-linfo-deplezione ha consentito di potenziare efficacemente l'ACT
ottenendo risposte cliniche oggettive in circa il 50% dei pazienti con melanoma metastatico
(Gattinoni, Powell et al. 2006).
Targeting immunoterapeutico: inibizione dell’attività delle MDSC
Dato che le MDSC prendono parte ad uno dei principali circuiti immunosoppressivi durante lo
sviluppo tumorale, sono al momento studiati diversi approcci farmacologici che mirano a
eliminare queste cellule o a modularne la funzione. Queste terapie, che si propongono come
supporto all’immunoterapia anti-tumorale, possono agire interferendo con diversi aspetti della
biologia delle MDSC: reclutamento e accumulo agli organi linfoidi secondari, maturazione e
attivazione. Alcune strategie che mirano ad eliminare in modo non selettivo la popolazione
CD11b+Gr-1+, quali l’utilizzo di anticorpi depletanti anti-Gr-1 o l’impiego di chemioterapici
come la gemcitabina, hanno dato risultati incoraggianti in termini di recupero della risposta T
anti-tumorale (Bronte, Chappell et al. 1999; Terabe, Matsui et al. 2003; Suzuki, Kapoor et al.
36
2005); questi trattamenti, però, eliminando oltre alle cellule MDSC anche altre cellule mieloidi, tra
cui i granulociti maturi, vanno valutati con cautela perchè possono rendere l’ospite suscettibile ad
infezioni opportunistiche. Il reclutamento di MDSC può essere ostacolato anche dall’inibizione di
STAT3, come accade con l’inibitore dell’attività tirosin chinasica Sunitinib, che riduce le MDSC
in pazienti con carcinoma renale, o di COX2, con riduzione sia del numero di MDSC, che della
loro attività (Talmadge, Hood et al. 2007; Ko, Zea et al. 2009).
un altro possibile intervento terapeutico riguarda il blocco dell’attività delle MDSC,
prevalentemente tramite l’inibizione degli enzimi ARG1 e NOS2. Inibitori specifici dei due
enzimi, purtroppo, non sono utilizzabili in clinica, a causa dei severi effetti collaterali che possono
causare. Recentemente, però, alcuni farmaci utilizzati in clinica per altre patologie, si sono
dimostrati efficaci nell’alterare l’azione di questi due enzimi, migliorando la risposta anti-tumorale.
Le nitro-aspirine, da un lato, interferiscono con la via di NOS2 grazie al loro gruppo NOdonatore, e probabilmente con quella di ARG1 mediante la porzione salicilica, che può anche
inibire COX2 (De Santo, Serafini et al. 2005); dall’altro, inibitori della fosfodiesterasi 5 (PDE5)
migliorano il reclutamento di linfociti T al tumore e riducono l’espressione di NOS2 e ARG1
(Serafini, Meckel et al. 2006). Con i recenti studi sulle sottopopolazioni di MDSC e i loro
meccanismi si potranno disegnare strategie terapeutiche sempre più mirate all’inibizione, fisica o
funzionale, solo della frazione cellulare realmente soppressiva, riducendo così al minimo le
conseguenze di una mielo-ablazione marcata. Infine, un altro approccio interessante, utile
soprattutto nelle fasi iniziali dello sviluppo tumorale, quando l’accumulo di MDSC è ancora
limitato, è la conversione di queste cellule in cellule dendritiche mature che funzionino da APC.
La 1-α25-diidrossivitamina D3, un metabolita della vitamina D3, è in grado di ridurre l’induzione
di MDSC a favore di cellule dendritiche mature, principalmente bloccando il rilascio di GM-CSF
(Young, Halpin et al. 1993; Lathers, Clark et al. 2004). Un simile effetto di maturazione di MDSC
verso DC mature, con miglioramento della risposta immune anti-tumorale, si ha con l’utilizzo di
acido trans-retinoico (ATRA) (Kusmartsev, Cheng et al. 2003).
Vari trattamenti farmacologici sono stati presi in esame per individuare molecole che in modo
specifico alterino l’espressione endogena o la funzione di fattori di trascrizione per esempio nel
trattamento della leucemia e che forse potrebbero essere impiegati per alterare la mielopoiesi ed
avere effetto sull’accumulo e sull’attività delle MDSC (Duprez, Wagner et al. 2003; Mueller, Pabst
et al. 2006). La maggiore speranza oggi comunque è riposta nelle terapie che implicano l’impiego
di molecole quali i microRNA (miRNA). Queste molecole sono cruciali per lo sviluppo del
sistema immunitario e l’ematopoiesi, processi che vengono infatti notevolmente alterati da
37
delezioni di specifici step della biogenesi dei miR (Muljo, Ansel et al. 2005; O'Carroll,
Mecklenbrauker et al. 2007; Lodish, Zhou et al. 2008; Li, Han et al. 2009).
Utilizzo terapeutico delle MDSC
Come già riportato sopra, una popolazione MDSC immunosoppressiva oltre che in presenza di
tumori è frequentemente aumentata in molte altre condizioni patologiche. L’espansione delle
MDSC è stata associata anche con infiammazione ed autoimmunità. Nella encefalomielite
sperimentale autoimmune (EAE), un modello murino di sclerosi multipla, è stato osservato un
aumento nel numero di MDSC (in particolare della sottopopolazione monocita ria CD11b+Ly6GLy6Chi) nella milza e nel sangue degli animali affetti da questa patologia. Queste cellule
penetravano nel sistema nervoso centrale durante la fase infiammatoria di questa malattia (Zhu,
Bando et al. 2007). Un considerevole incremento nel numero delle MDSC è stato rilevato nella
uveo-retinite sperimentale autoimmune, un modello animale della malattia infiammatoria umana
intraoculare (Kerr, Raveney et al. 2008), sulla pelle e nella milza di topi ripetutamente trattati con
un sensibilizzante da contatto per indurre una risposta infiammatoria (Marhaba, Vitacolonna et al.
2007), e nelle malattie infiammatorie dell’intestino (Haile, von Wasielewski et al. 2008). Le MDSC
sono state individuate anche nella milza dei topi in un modello di stress traumatico (Makarenkova
JImmunology 2006) dove sopprimono le funzioni delle cellule T ed in topi normali in seguito
all’immunizzazioine con differenti antigeni quali ovalbumina , peptide con CFA o con vaccinia
virus ricombinante esprimente IL-2 (Bronte, Wang et al. 1998; Cauley, Miller et al. 2000;
Kusmartsev and Gabrilovich 2003); nelle infezioni (Delano, Scumpia et al. 2007)e nei trapianti
(Dugast, Haudebourg et al. 2008). In tutte queste situazioni la presenza delle MDSC è
responsabile di una miglior prognosi
di malattia. Recenti studi hanno quindi mostrato la
possibilità di indurre o trasferire queste cellule in vivo mantenendo il loro
potenziale
immunosoppressivo.
In uno studio recente, le MDSC espanse in vivo dalla somministrazione di G-CSF sopprimevano
l’inizio della reazione “graft-versus-host disease”(GVHD) dopo il trapianto allogenico inducendo
una popolazione di cellule Treg ristrette per MHC-classe II secernenti IL-10 (MacDonald, Rowe
et al. 2005). Due aspetti di questa ricerca appaiono intriganti:(1) mentre la GVHD era prevenuta
efficacemente, l’effetto graft-versus-leukimia del trapianto di midollo osseo veniva mantenuto; (2)
soltanto le MDSC, ma non le DC plasmacitoidi o mieloidi erano in grado di influenzare la
GVHD, suggerendo la superiorità delle MDSC meccanismi di induzione della tolleranza. Steptoe
ed i suoi collaboratori hanno trasferito in vivo cellule progenitrici mieloidi parzialmente
differenziate codificanti specifici auto-antigeni di malattia con lo scopo di prevenire il diabete
38
autoimmune. Essi hanno trasferito le cellule mieloidi progenitrici codificanti proinsulina nei topi
NOD. Queste colture che inducevano cellule CD11b+/Gr-1+ quando erano trasferite nei topi
NOD di quattro settimane sopprimevano significativamente lo sviluppo del diabete. Come nel
caso della GVHD, le MDSC ma non le DC immature sopprimevano lo sviluppo del diabete
(Steptoe, Ritchie et al. 2005).
La terapia mediante trasferimento adottivo cellulare impiegando le MDSC può quindi
rappresentare un’attraente opportunità attraverso cui inibire le risposte immunitarie nelle malattie
autoimmuni o nei trapianti. Questo richiede di escogitare metodi per generare queste cellule ex
vivo in condizioni di “clinical-grade”, in modo che siano adatte per essere somministrate ai
pazienti. In questo lavoro abbiamo tentato di utilizzare le conoscenze acquisite sul
differenziamento e la funzione delle MDSC per generare in vitro queste cellule con funzione
tollerogenica per poterle utilizzare in vivo come cellule regolatrici del sistema immunitario.
39
40
MATERIALI E METODI
Topi. Sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6 (aplotipo H-2b), BALB/c (aplotipo H-2d) ed
FVB (aplotipo H-2q) di età compresa tra le otto e le dodici settimane, della ditta Harlan (San
Pietro al Natisone, Italy). Topi transgenici CL4 di background BALB/c esprimenti un α/β TCR
ristretto in Kd per il peptide HA512-520 derivati da una coppia originaria ottenuta da L. Sherman
(The Scripps Research Institute, La Jolla, CA). Topi transgenici 6.5 Tg di background BALB/c
esprimenti un α/β TCR ristretto per il peptide HA110-120 derivati da una coppia originaria
ottenuta da Hy Levitsky (Johns Hopkins, Baltimore, MD), topi transgenici pmel-1 di background
C57BL/6 che esprimono il Vα1Vβ13 TCR che lega in modo specifico il peptide murino ed
umano gp10025-33 ristretto per H-2Db (Overwijk, Theoret et al. 2003) provenienti da N. Restifo
(Surgery Branch, National Institutes of Heath, Bethesda, MD). Abbiamo acquistato inoltre dalla
Jackson
Laboratories
i
topi
knock
out
per
iNOS-/-,
i
topi
Tg(TCRαTCRβ))1100mjb) con TCR transgenico per il peptide OVA
OT-1
257-264
(C57Bl/6-
di background
C57BL/6 ed i topi congenici CD45.1+. Esta Sterneck (NCI, Frederick, MD) ci ha fornito i topi
B6 CRP CKO+ neo chiamati anche c/ebpβflox/flox con il gene C/EBPβ floxato. I topi Tie2Cre ci
sono stati forniti da P.J. Murray (Department of Immunology, St. Jude Children’s Research
Hospital, Memphis, Tennessee). Abbiamo generato topi con una delezione inducibile di
C/EBPβ, incrociando topi c/ebpβflox/flox a topi Tie2Cre, i quali esprimono la ricombinasi Cre sotto il
controllo del promotore murino Tie2. Tutti gli animali sono stati mantenuti in condizioni prive di
patogeni presso lo stabulario dell’ Istituto Oncologico Veneto (Padova, Italy) e tutti gli
esperimenti eseguiti sugli animali si sono attenuti alle linee guida indicate dalle direttive nazionali
ed internazionali.
Linee cellulari. N202.1A, una linea cellulare clonata da topi di background FVB (H-2q)
transgenici per il protooncogene di ratto Her-2/Neu (FVBNeuN) ceduta da M.P. Colombo
(National Institutes of Tumors, Milan, Italy). Le linee cellulari: TS/A, N2C e 4T1 di carcinoma
mammario, RenCa una linea cellulare di carcinoma renale, P815 una linea di mastocitoma, CT26
linea di colon carcinoma indifferenziato indotto mediante carcinogenesi chimica sono tutte
derivate da topi BALB/c (aplotiopo H-2d). Le linee: MBL-2 di linfoma, EL-4 di timoma,
MCA203, di fibrosarcoma indotto da 3-methylcholanthrene, ed EG-7, la linea di timoma EL-4
transfettata con ovalbumina di pollo (OVA) sono tutte derivate da topi C57BL/6 (aplotipo H-2b).
La linea cellulare C26-GM (aplotipo H-2d) è stata derivata dalla linea di colon carcinoma C26
geneticamente modificata per rilasciare GM-CSF. Brevemente, il cDNA codificante per il GM-
41
CSF è stato clonato nel vettore retrovirale LXSN, ed utilizzato per infettare cellule C26. Le cellule
C26-GM utilizzate in questo studio producono GM-CSF a livelli di 10–15 ng/ml per 106 cellule
in 48 h e sono state mantenute in coltura con terreno addizionato con l’antibiotico geneticina
(G418, Gibco) alla concentrazione di 0,8 mg/ml che consente di selezionare la popolazione
transfettata.. Queste linee cellulari sono state cresciute in DMEM (Invitrogen) addizionato con 2
mM L-glutammina, 10 mM HEPES, 20 µM 2-ME, 150 U/ml streptomicina, 200 U/ml
penicillina, ed il 10% di siero fetale bovino inattivato dal calore (FBS, Gibco, CA, U.S.A.).
Citochine e peptide sintetici. Le citochine ricombinanti murine GM-CSF, G-CSF, IL-6 ed IL-4
sono state acquistate da Peprotech Inc. I peptidi HA512-520 (IYSTVASSL) ristretto per l’aplotipo
H-2 Ld, HA110-119 (SFERFEIFPK) ristretto per I-Ed, OVA
257-264
(SIINFEKL) ristretto per
l’aplotipo H-2 Kb, β-gal96-103 (DAPIYTNV) ristretto per l’aplotipo H-2 Kb, hgp10025-33
(KVPRNQDWL) ristretto per l’aplotipo H-2 Db ed il peptide NP366-374 (ASNENMETM) ristretto
per l’aplotipo H-2 Db sono stati tutti sintetizzati dalla JPT (Berlin, Germany). Tutti i peptidi
impiegati avevano una purezza superiore al 95% indicata dall’analisi HPLC. I peptidi liofilizzati
sono stati risospesi in DMSO (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO,U.S.A.) e stoccati a –80 °C fino al
momento dell’uso.
Colture dal midollo osseo e generazione di cellule dendritiche. Le tibie ed i femori di topi
BALB/c o C57BL/6 sono state rimosse utilizzando tecniche sterili ed il midollo osseo è stato
flussato. I globuli rossi sono stati lisati con una soluzione di cloruro di ammonio. Per ottenere
MDSC dalle colture di midollo, 2.5x106 cellule sono state piastrate in dischi petri del diametro di
100mm (Falcon, Beccton Dickinson) in 10 ml di terreno addizionato con differenti combinazioni
di citochine GM-CSF (40 ng/ml), G-CSF (40 ng/ml), ed IL-6 (40 ng/ml). Le colture così allestite
sono state incubate per 4 giorni a 37°C in atmosfera satura di vapore acqueo e contente il 5% di
CO2. Le cellule sono state quindi raccolte, lavate in terreno e, quando richiesto, incubate a 37°C
per 2h con il peptide HA512-520 (IYSTVASSL). Quando utilizzate nei protocolli di trasferimento
adottivo, le cellule sono state lavate un paio di volte, risospese in PBS ed inoculate i.v. nei topi a
differenti concentrazioni.
Per ottenere cellule dendritiche (DC) da topi BALB/c, le cellule del midollo osseo sono state
piastrate a 5x106 cellule a pozzetto in piastre da 6 pozzetti, in 3ml di terreno per pozzetto,
addizionato con 20 ng/ml di GM-CSF e 100 ng/ml di IL-4. Le colture così allestite sono state
incubate a 37°C in atmosfera satura di vapore acqueo e contente il 5% di CO2. Il terzo giorno di
coltura, le cellule in sospensione sono state delicatamente rimosse, ed è stato sostituito il terreno
42
fresco con le citochine. Al giorno 6 di coltura le DC sono state attivate e caricate con il peptide
mediante l’incubazione per una notte in coltura con 1 µg/ml di LPS (Sigma) e 2 µg/ml di HA512520
(IYSTVASSL). Il giorno 7 le cellule sono state raccolte, lavate ed inoculate s.c. in numero di
2x105 in un volume di 200 µl su entrambi i fianchi di ciascun topo. Entrambi i tipi di coltura sono
state mantenenute in incubatore a 37 °C al 5% CO2 utilizzando il terreno RPMI con 10% FBS
(Biochrom) inattivato al calore addizzionato con 2 mM di L-glutammina, 1 mM di sodio piruvato,
150 U/ml di streptomicina, 200 U/ml di penicillina, 20 µM di 2β-mercaptoetanolo
Separazioni cellulari. Le cellule T CD8+ sono state isolate dalle milze di topi transgenici CL4 e
le cellule T CD4+ dalle milze di topi transgenici 6.5 utilizzando kit per sorting immunomagnetici
per selezione negativa rispettivamente per i CD8 ed i CD4. I linfociti T CD4+CD25+ e
CD4+CD25- sono state arricchite immuno-magneticamente, dalle milze dei topi transgenici 6.5,
utilizzando il kit di isolamento CD4/CD25. Le cellule CD11b+ sono state isolate da diversi tessuti
murini, utilizzando microbiglie magnetiche coniugate con l’anticorpo monoclonale di ratto antiCD11b umano e murino. Tutte le separazioni immunomagnetiche sono state effettuate
utilizzando colonne MidiMacs e kit della ditta Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany). La
purezza delle popolazioni cellulari sortate è stata valutata mediante analisi citofluorimetrica e
superava il 90%.
Anticorpi per citofluorimetria. Sono stati utilizzati i seguenti Abs murini: CD11b-PerCPCy5.5,
Gr-1-APC, CD124-PE, CD62L-FITC, CD11c-FITC, Ly6G-PE, Ly6C-FITC, I-A/I-E-FITC,
IFN-γ-FITC, CD8a-PE/Cy5 tutti forniti dalla ditta BD Pharmingen; F4/80-FITC fornito dalla
ditta AbD Serotec; CD45.2-PE e CD90.1(Thy1.1)-PE forniti dalla eBioscience; CD4-PECy5 e
FOXP3-Alexa Fluor 647 forniti dalla ditta Biolegend.
Analisi citofluorimetrica. Le cellule (106) sono state risospese in 50 μl di FACS buffer (una
soluzione contenente 0.9% di NaCl , 2% BSA e 0.02% NaN3) (Sigma) a cui è stato aggiunto un
anticorpo anti-mouse Fc-γ receptor 2.4G2 (clone HB-197, ATCC) per ridurre i siti aspecifici, per
10 minuti a temperatura ambiente. I campioni sono poi stati lavati e risospesi in 50 μl di FACS
buffer per la marcatura con le appropriate quantità di anticorpi. Dopo una incubazione di 20
minuti a 4°C, le cellule sono state lavate, risospese in 200 µl di FACS buffer ed analizzate con il
citofluorimetro. Per l’analisi citofluorimetrica della produzione intracellulare della citochina IFNγ, le cellule sono state incubate per 10 h con Golgi stop (BD Pharmingen). Dopo la marcatura di
superficie, con gli anticorpi CD90.1(Thy-1.1)-PE e CD8a-PE/Cy5 le cellule sono state lavate con
43
PBS, fissate e permeabilizzate per 20 min a 4 °C con Cytofix/Cytoperm (BD Pharmingen). Le
cellule sono quindi state lavate con Perm/ Wash (BD Pharmingen) e successivamente marcate in
Perm Wash con anti-mouse IFN-γ. La marcatura intracellulare per FOXP3 è stata effettuata
seguendo le istruzioni della ditta (Biolegend). Dopo la marcatura le cellule sono state lavate e
risospese in 200µl di FACS buffer ed analizzate. L’acquisizione dei dati è stata effettuata con il
citofluorimetro FACSCalibur (BD Biosciences, Mountain View, CA, U.S.A.) ed analizzati
impiegando il programma FlowJo (Tree Star, Inc.).
Marcatura con CFSE e saggio di proliferazione. Le cellule T CD4+ o T CD4+/CD25+ o T
CD4+/CD25- derivate da topi naïve Thy1.1+ 6.5 sono state lavate due volte con PBS e risospese
alla concentrazione di 2x107 cells/ml in PBS e marcate con 0.5 μM di carboxyfluorosceindiacetate,succinimidyl estere (CFSE) (Invitrogen Molecular Probe) per 5 min a 37 °C.
La marcatura è stata bloccata lavando due volte con PBS addizionato con 1/5 del volume di
siero, le cellule sono state pulsate o meno per 2 h con il peptide specifico HA110-119
(SFERFEIFPK) e poi mescolate con cellule “feeder” costituite da splenociti BALB/c γ-irradiati.
Alcune condizioni colturali prevedevano l’aggiunta in coltura come terza parte di MDSC ottenute
dal midollo osseo o dal tumore eventualmente pulsate per 2 h con il peptide specifico HA110-119
(SFERFEIFPK). Dopo 72 h le colture sono state raccolte e marcate con anticorpi anti-CD4 ed
anti-Thy1.1 e la proliferazione è stata determinata dalla diluizione del CFSE all’interno della
popolazione clonotipica considerata. Per ogni campione sono stati raccolti un totale di 105 eventi
con il citofluorimetro FACSCalibur (BD Biosciences, Mountain View, CA, U.S.A.) ed i dati
ottenuti sono stati analizzati impiegando il programma FlowJo (Tree Star, Inc.).
Test E.L.I.S.A. (Enzyme-Linked Immunoassorbent Assay). Le cellule tumorali o le frazioni
CD11b+ o CD11b- isolate dal microambiente tumorale sono state mantenute in coltura in
pozzetti da 24 (Falcon, Beccton Dickinson) alla concentrazione di 5x105 cellule. Dopo 48 h, i
surnatanti delle colture sono stati saggiati mediante test E.L.I.S.A. per il rilascio delle citochine
GM-CSF (Endogen), IL-6 (eBioscience) e G-CSF (Biosource) seguendo i protocolli forniti dalle
ditte fornitrici. Il rilascio della citochina IFN-γ (Endogen) è stato valutato nei surnatanti delle
colture delle milze e dei linfonodi mesenterici dei topi allotrapiantati stimolate per 5 giorni con
insule pancreatiche disgregate.
Test ELISPOT (Enzyme-Linked Immunoassorbent Spot Assay). Il saggio è stato eseguito
usando il KIT per la rilevazione di IFN-γ murino (BD Pharmingen, Mountain View, CA, U.S.A.)
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seguendo le istruzioni allegate, utilizzando le piastre MULTIscreen HTS (Millipore, NJ, U.S.A.).
Ciascun pozzetto conteneva 5x105 cellule isolate dai linfonodi. Il numero di spot è stato valutato
in triplicato, in risposta alla stimolazione con il peptide specifico e di controllo (1 µg/ml)
impiegando il lettore automatico di piastre KS e il relativo software.
Colture leucocitarie miste stimolate con peptide (MLPC)
Le colture MLPC in ceppo BALB/c sono state allestite mescolando splenociti BALB/c γ-irradiati
e splenociti di topi CL4, aventi linfociti T CD8+ HA-specifici, in rapporto tale da ottenere l’1% di
CTL HA-specifici nella coltura finale. 6x105 cellule sono state piastrate in piastre da 96 pozzetti
con fondo piatto (BD Falcon) e stimolate per 5 giorni con 1 µg/ml del peptide HA512-520. In
ceppo C57BL/6 gli splenociti sono stati mescolati con cellule provenienti dalla milza di topi
pmel-1, aventi linfociti T CD8+ gp100-specifici, in rapporto tale da ottenere il 2% di CTL gp100specifici nella coltura finale. 6x105 cellule sono state piastrate in piastre da 96 pozzetti con fondo
piatto (BD Falcon) e stimolate per 5 giorni con 1 µg/ml del peptide hgp10025-33. Dove previsto,
cellule MDSC (derivate da sorting immunomagnetico o da colture di midollo osseo con
citochine) sono state aggiunte come terza parte alle colture, in percentuali scalari che vanno dal
12% al 3% della coltura MLPC. Le colture sono state mantenute in terreno RPMI con 10% FBS
(Biochrom) inattivato al calore, 2 mM di L-glutammina, 1 mM di sodio piruvato, 150 U/ml di
streptomicina, 200 U/ml di penicillina, 20 µM di 2β-mercaptoetanolo, in incubatore a 37 °C al
5% CO2.
Colture leucocitarie miste (MLR)
Nelle colture MLR 6 x 105splenociti da topi BALB/c sono stati incubati con 6x105 splenociti γirradiati da topi C57BL/6 o FVB in piastre da 24 pozzetti (BD Falcon) per 5 giorni. Le colture
sono state mantenute in incubatore a 37 °C al 5% CO2 in terreno RPMI con 10% FBS
(Biochrom) inattivato al calore adizzionato con 2 mM di L-glutammina, 1 mM di sodio piruvato,
150 U/ml di streptomicina, 200 U/ml di penicillina, 20 µM di 2β-mercaptoetanolo.
Valutazione della citotossicità mediante saggio di rilascio di 51Cromo
L’attività litica delle colture MLPC è stata valutata mediante un saggio citotossicità a breve
termine di incubazione, utilizzando come target cellulari, per colture BALB/c, la linea CT26,
pulsata o meno con il peptide HA512-520 (1x106 di cellule con 1 µg di peptide). o, per colture
C57BL/6, la linea MBL-2, pulsata o meno con il peptide hgp10025-33. Per saggiare l’attività litica
delle colture MLR si sono utilizzate come cellule target rispettivamente la linea MBL nel caso di
45
colture stimolate da splenociti γ-irradiati da topi C57BL/6 e la linea N202.1A nel caso di colture
stimolate da splenociti γ-irradiati da topi FVB ed in entrambi i casi la linea CT26 come target
scorrelato. Le cellule target sono state incubate per un’ora a 37 °C con 100 μCi Na2 51CrO4
(PerkinElmer). Al termine della marcatura le cellule sono state opportunamente lavate e quindi
risospese in terreno RPMI 5% FBS, alla concentrazione di 2x104/ml; 100μl di tale sospensione
cellulare sono stati seminati in una micropiastra da 96 pozzetti con fondo a U in presenza di
diluizioni scalari di cellule effettrici derivate dalle MLPC o dalle MLR distribuite anch’esse in
100μl ed in triplicato. Le micropiastre sono state centrifugate per 1 minuto ed incubate a 37 °C
per 5 h. Dopo l’incubazione, da ogni pozzetto sono stati prelevati 30μl di surnatante e trasferiti in
micropiastre con scintillante solido (PerkinElmer). Dopo aver lasciato asciugare le piastre, la
radioattività emessa è stata misurata con un contatore di scintillazione γ per piastre (Top Count,
PerkinElmer). La percentuale di lisi specifica è stata calcolata da ciascun pozzetto utilizzando la
seguente formula:
% lisi = 100 ⋅
(R sper − R min )
(R max − R min )
dove Rsper è il rilascio sperimentale di ciascun pozzetto di co-coltura effettori/target, Rmin è il
rilascio spontaneo di cellule target in assenza di effettori e Rmax è il rilascio massimo ottenuto
dopo lisi forzata delle cellule, ottenuta incubando i target con RPMI 5% FBS con SDS 0.5%. Le
unità litiche al 30% (L.U.30) sono state calcolate come il numero di cellule effettrici in grado di
indurre il 30% di lisi in 2000 cellule target. La percentuale di L.U.30 è stata calcolata come il
rapporto tra L.U.30 del gruppo sperimentale e L.U.30 del gruppo di controllo (coltura MLPC
senza MDSC).
Terapia Cellulare mediante trasferimento adottivo. L’ACT (Adoptive Cell Therapy) è stata
effettuata nei topi dopo inoculazione s.c. di 1x106 cellule della linea tumorale MCA203. Dopo 14
giorni dall’inoculo del tumore (quando l’area del tumore raggiungeva circa i 20 mm2), alcuni
gruppi di animali sono stati mielo-linfo-linfodepletati tramite γ-irradiazione total-body (500 cGy).
Dopo 6h, 5x106 CTL specifici per mTERT sono stati inoculati i.v. negli animali (i topi del gruppo
di controllo sono stati inoculati con CTL specifici per β-gal). Nel momento del trasferimento dei
CTL, i topi sono stati inoculati i.m. con 5x108 PFU del vettore ricombinante adenovirale
codificante per l’antigene riconosciuto dalle cellule T trasferite e poi sono stati inoculati i.p. con
interleuchina ricombinante umana IL-2 (30,000 IU) che è stata somministrata due volte al giorno,
per 3 giorni consecutivi. Le dimensioni del tumore sono state monitorate ogni due giorni. Gli
46
animali sono stati sacrificati quando il tumore raggiungeva i 100mm2 . I CTL specifici sia per l’
antigene mTERT sia β-gal sono stati mantenuti in coltura con splenociti C57BL/6 γ-irradiati
pulsati con i peptidi rispettivamente 0.1 µM di mTERT198-205 (VGRNFTNL) o 1 µM di β-gal96-103
(DAPIYTNV). Le colture sono state cresciute per 7 giorni in terreno completo contenente 20
IU/ml di IL-2 ricombinante umana (Novartis, Basel, Switzerland).
Induzione di diabete. Ai topi BALB/c riceventi il trapianto è stata somministrata
Streptozotocina (STZ, 150 mg/kg, i.p.) (Sigma-Aldrich Inc., MO, USA) per indurre il diabete. La
soluzione di STZ è stata preparata immediatamente prima dell’uso, in buffer citrato pH 4.6. La
glicemia è stata monitorata ogni 1-2 giorni prima del trapianto (utilizzando un glucometro (AccuChek Avviva Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), ed il diabete è stato confermato da due
misure consecutive del glucosio nel sangue >250 mg/dl.
Isolamento di insule. Le insule sono state isolate da donatori BALB/c (singenici) o C57BL/6
(allogenici) o FVB (allogenici) impiegando i protocolli pubblicati con poche modifiche
(Salvalaggio, Deng et al. 2002). Brevemente, i topi donatori sono stati anestetizzati e
immediatamente sacrificati mediante dissanguamento. Il dotto biliare principale è stato clampato
a livello dell’Ampolla di Vater, e 2-3 ml di soluzione di collagenasi alla concentrazione di 2.5
mg/ml (Type V, Sigma-Aldrich) sono stati perfusi nel pancreas mediante incanulazione del dotto
biliare. I pancreas perfusi sono quindi stati asportati con cura e mantenuti in ghiaccio nella
soluzione di collagenasi per essere digeriti. La digestione dei pancreas è stata poi eseguita
mediante incubazione statica a 37°C per 15 minuti. Dopo un paio di lavaggi in HBSS , e
filtrazione attraverso un filtro di nailon della porosità di 500 μm, la sospensione di insule è stata
purificata mediante centrifugazione utilizzando il gradiente di densità Histopaque (SigmaAldrich). La frazione contenente le insule è stata delicatamente raccolta, lavata e filtrata attraverso
una membrana di nailon della porosità di 70 μm (Becton Dickinson Falcon, MA, USA). Ogni
tessuto contaminante rimasto è stato rimosso manualmente con l’ausilio di un microscopio
ottico. Le insule sono state mantenute in coltura per l’intera notte in terreno RPMI
supplementato con 5.5 mM di glucosio, 10% FCS, 0.25% HEPES, 100 U/ml penicellina, 100
µg/ml streptomicina e trapiantate entro 24h dall’isolamento.
Trapianto di insule. Le insule sono state trapiantate sotto la capsula del rene sinistro dei topi
riceventi resi diabetici dalla somministrazione della STZ come precedentemente descritto
(Machen, Bertera et al. 2004). Brevemente, 400 insule equivalent (IEQ) sono state trasferite in un
47
tubicino PE-50 tubing (Becton Dickinson, Intramedic tubing, MD, USA) e sono state lasciate
sedimentare per gravità. I topi sono stati anestetizzati, il fianco sinistro è stato rasato, e l’accesso
al rene è stato ottenuto grazie ad una piccola incisione lombare. Il rene è stato sollevato fuori su
di una garza sterile, e la capsula rotta al polo inferiore. Il tubicino, contenente le insule impaccate
ad una estremità, è stato collegato ad una siringa Hamilton, e le insule sono state lentamente
iniettate nello spazio sub-capsulare. Dopo la rimozione del tubicino, la rottura è stata cauterizzata
per prevenire la perdita delle insule. Il rene è stato riposizionato, il muscolo peritoneale
rimarginato con suture, e l’incisione sulla pelle richiusa utilizzando clips Michel. Antibiotici sono
stati somministrati immediatamente dopo ed ogni 3-4 giorni dopo l’intervento chirurgico, per la
durata dell’intero periodo di trattamento con le MDSC. Le clips sono state rimosse dopo 15
giorni dall’intervento. Il momento del rigetto del trapianto è stato definito da due misure
consecutive del glucosio nel sangue >250 mg/dl dopo un periodo di glicemia stabile.
Analisi Immunoistochimica. I reni trapiantati con le insule ed i pancreas sono stati fissati in
soluzione di formalina neutra al 10%, ed inclusi in paraffina per essere sezionati. Dopo lo
smascheramento degli antigeni in buffer citrato pH 6.0, la reattività endogena all’avidina e biotina
è stata bloccata utilizzzando un kit avidin/biotin blocking kit (Vector Laboratories Inc., CA,
USA), ed il legame aspecifico è stato bloccato utilizzando un agente bloccante le proteine
(UltraTech HRP Streptavaidin-Biotin Detection System, Immunotech SAS, Beckman Coulter,
Marseille, France). Sezioni seriali dei reni sono state colorate con i seguenti anticorpi primari
(diluiti 1:200): anti-mouse CD4 (ReliaTech GmbH, Germany), anti-mouse CD8a (ReliaTech) and
anti-human insulin (E2E3, AbD Serotec, Oxford, UK). Il legame dell’anticorpo primario è stato
rivelato dalla reazione con un Ab policlonale secondario biotinilato, seguito dall’aggiunta del
reagente streptavidina-peroxidasi (Immunotech SAS) ed i segnali positivi sono stati rivelati
utilizzando la soluzione di diaminobenzadine (1:50, DakoCytomation Inc., CA, USA). Le sezioni
sono state contromarcate con Mayer’s hematoxylin (Diapath, Martinengo Bergamo, Italy). Per
ciascuna reazione, sono stati inclusi sempre i controlli positivi (le milze e linfonodi di topi) ed i
contolli negativi (assenza dell’anticorpo primario).
Purificazione dell’ RNA totale ed analisi mediante real time PCR. L’ RNA totale è stato
estratto dalle cellule mediante TRIzol (Invitrogen) in accordo con le istruzioni riportate dal
manuale con lievi modifiche. La qualità e quantità dei campioni di RNA è stata determinata
utilizzando l’Agilent RNA 6000 Nano Chip (Agilent Technologies). I cDNA sono stati ottenuti
utilizzando la transcriptasi inversa M-MLV (Invitrogen) seguendo il manuale d’istruzioni. 20 ng di
48
templato cDNA sono stati utilizzati per eseguire delle TaqMan® Real Time PCR (2 minuti a
50°C, 10 minuti a 95°C, 15 secondi a 95°C, 1 minuto a 60°C, per 45 cicli) utilizzando lo
strumento ABI prism 7900HT (Applied Biosystems) utilizzando i seguenti “assays-on-demand”
murini (Applied Biosystems): gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (Gapdh), arginasi 2 (Arg2),
ossido nitrico sintetasi 1 (Nos1), ossido nitrico sintetasi 3 (Nos3), citocromo b-245, alpha
polipeptide (Cyba), citocromo b-245, beta polipeptide (CyBb). Il ciclo soglia o “Threshold
Cycle”(Ct) è stato determinato manualmente e l’espressione del “fold change"è stata calcolata
come descritto da Applied Biosystem’s User Bulletin #2.
Analisi di espressione genica. I profili di espressione genica sono stati realizzati su piattaforma
Affymetrix MOE430 plus, secondo le indicazioni dell’Affymetrix GeneChip® Expression
Analysis Technical Manual. I controlli qualitativi pre-ibridizzazione sono stati eseguiti su Agilent
2100 Bioanalyzer (Agilent Tecnologies), mentre i controlli sui dati post-ibridizzazione sono stati
eseguiti in ambiente R, utilizzando i pacchetti della libreria Bioconductor (http://www.rproject.org/,R Development Core Team, 2008): affyQCReport e AffyPLM.
I dati grezzi ottenuti dalla scansione dei micro-array sono stati normalizzati utilizzando il
pacchetto RMA ed il file di definizione mouse43020mmentrezg (custom-CDF) (version 11.0.1;
http://brainarray.mbni.med.umich.edu/Brainarray/Database/CustomCDF/11.0.1/entrezg.asp),
che riorganizza le 45037 sonde oligonucleotidiche in 16331 meta-sonde, sulla base dell’ultima
versione del database Entrez Gene. I geni espressi differenzialmente nei vari campioni sono stati
evidenziati utilizzando il pacchetto RankProd, che impiega un metodo non parametrico per
organizzare i geni in una lista ordinata sulla base dell’abbondanza stimata dei trascritti; ad ogni
gene viene attribuito un livello di significatività (p-value), nella forma di un indice di predizione
dei falsi positivi (pfp). In particolare, nella comparazione tra le cellule CD11b+ che infiltrano il
tumore e le cellule CD11b+ ottenute dalla milza di topi sani, sono stati identificati come
significativamente sovra- o sotto- espressi, quei geni a cui era associato un pfp ≤ 0.0005.
Applicando questo filtro, sono stati identificati 74 geni, che presentano livelli di espressione
differenti nei campioni sani di controllo ed in quelli ottenuti dal’infiltrato tumorale. Il pacchetto
di dati così estrapolato, è stato annotato funzionalmente sulla base delle informazioni ottenute da
vari database pubblici: DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/), the Kyoto Encyclopedia of
Genes and Genomes (KEGG; http://www.genome.jp/kegg/) e NCBI Gene databases (NCBI;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene).
L’analisi
per
clusterizzazione
agglomerativa è stata prodotta utilizzando il coefficiente di correlazione di Pearson per calcolare
la distanza tra i vari campioni e il collegamento medio per calcolarne i rapporti di relazione.
49
Western blot. Le cellule sono state processate per l’estrazione delle frazioni nucleare e
citoplasmatica utilizzando il kit per estrazione NE-PER (Pierce Biotecnology), seguendo le
istruzioni del manuale in presenza di una serie di inibitori delle proteasi (Protease Inhibitor
cocktail III, calbiochem), 0.5 mM EDTA, 2 mM PMSF (SIGMA Aldtrich), 1 mM NaOV4
(SIGMA Aldrich). La quantificazione poteica è stata effettuata con il metodo Bradford; 20-50 µg
degli estratti nucleari sono stati separati su un gel di poliacrilamide denaturante al 12 % e trasferiti
su di una membrana di PVDF (Millipore) per 2 ore a 4 °C. La membrana è stata saturata per 1
ora a temperatura ambiente in PBS-Tween20 0.05% (PBS-T) supplementato con il 3% non-fat
dried Milk (Blocking buffer, Sigma-Aldrich). L’ibridizzazione dell’Ab primario è stata effettuata
con un rabbit policlonal anti-C/EBPβ (SC-150, 1:2000, Santa Cruz Biotecnology Inc) per 1 ora a
temperatura ambiente in PBS-T 3% BSA. L’ibridizzazione con l’anticorpo secondario, donkey
anti-rabbit IgG coniugato alla perossidasi (HRP) (Amersham Biosciences), è stata effettuata per 1
ora a temperatura ambiente in Blocking buffer. Per il controllo della quantità caricata, sono state
colorate le membrane PVDF con Brilliant Blue Comassie (SIGMA Aldrich), seguendo le
procedure standard.
Allo scopo di valutare l’espressione di Arg1 e Nos2, le proteine degli estratti citoplasmatici sono
state separate su un gel di poliacrilamide denaturante al 10% e trasferite su membrana di PVDF
per 2 ore a 4°C (Gallina, Dolcetti et al. 2006). La membrana è stata quindi saturata per 1 ora a
temperatura ambiente in PBS-Tween20 0.05% (PBS-T) supplementato con diverse
concentrazioni di non-fat dried Milk (Sigma-Aldrich): 5% per anti-Arg1, 3% per anti-Nos2 e 1%
per anti-actina. L’ibridizzazione con gli Ab primari è stata effettuata come segue: rabbit anti-Arg1
policlonale (1:1000, Santa Cruz Biotecnology Inc.) e rabbit anti-Nos2 policlonale (1:1000, Santa
Cruz Biotecnology Inc.) sono stati incubati over night a 4 °C in PBS-T BSA 3%, e anticorpo
rabbit anti-actina policlonale (1:5000, Sigma-Aldrich) per1 ora a temperatura ambiente in PBS-T
BSA 3%. L’ibridizzazione con l’anticorpo secondario donkey anti-rabbit IgG coniugato alla per
ossidasi (HRP) (Amersham Biosciences) è stata effettuata per 1 ora a temperatura ambiente in
Blocking buffer.
Le proteine sono state rilevate su pellicole Hyperfilm (Amersham) grazie al kit Supersignal West
Pico Chemiluminescent (Pierce).
Analisi statistiche. I dati sono espressi come media±SD. Gli esperimenti di sopravvivenza sono
rappresentati atraverso curve di Kaplan–Meier e la significatività è stata determinata con il logrank test. Lo Student’s t-test è stato utilizzato per confrontare gruppi parametrici. I valori sono
50
considerati statisticamente significativi con P<0.05. L’assenza di significatività non è stata
riportata per brevità.
Codici di accesso. I dati di espressione genica grezzi saranno disponibili pubblicamente sul sito
Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO/; GSExxxx) appena il lavoro
sarà pubblicato.
51
52
RISULTATI
Definizione dei fattori solubili che rilasciati nel microambiente tumorale sono in grado di
influenzare la mielopoiesi.
Il punto di partenza di questo lavoro è stato l'osservazione, precedentemente pubblicata dal
nostro gruppo, che molte linee tumorali di diversa istologia e background genetico rilasciano
GM-CSF (Bronte, Chappell et al. 1999). Abbiamo inizialmente voluto indagare altri fattori
solubili rilasciati dalle cellule tumorali in grado di poter influenzare la normale mielopoiesi. Linee
tumorali di differente istologia, derivate sia da topi BALB/c che C57BL/6, rilasciano oltre che
GM-CSF anche IL-6 e G-CSF, in quantità diversa (Fig. 1A). Considerando inoltre che anche le
cellule mieloidi infiltranti il tumore potrebbero produrre citochine ed altri fattori abbiamo
comparato i profili di espressione dell’ mRNA delle cellule CD11b+ isolate dalla milza di topi
BALB/c e C57BL/6 sani con quelle isolate dalle masse di diversi tumori solidi. Questo approccio
ci ha permesso di osservare possibili variazioni di un elevato numero di fattori, espressi dalle
cellule infiltranti il tumore, in grado di promuovere la mielogenesi. L’analisi dei profili di
espressione ha evidenziato un aumento dei livelli degli mRNA codificanti per IL-6, G-CSF, GMCSF, ma non per IL-3 (Fig. 1B). Nella comparazione appena descritta anche il fattore MCSF/CSF-1 non è emerso come differenzialmente regolato (dati non mostrati). Per confermare la
produzione di queste citochine abbiamo, successivamente, separato dalle masse tumorali di
quattro diverse istologie le cellule mieloidi CD11b+ dalle cellule CD11b- (che comprendono per la
maggior parte cellule tumorali) e le abbiamo coltivate in terreno per 48 h. Sebbene le citochine
GM-CSF, IL-6, o G-CSF siano prodotte da diverse popolazioni cellulari, esse vengono rilasciate
in differenti proporzioni nel microambiente di tutti i tumori analizzati ed IL-6 è la citochina
maggiormente prodotta (Fig. 1C). IL-6, inoltre, è spontaneamente prodotta anche da splenociti
CD11b+ isolati dai topi portatori degli stessi tumori (dati non mostrati).
Abbiamo quindi deciso di valutare se queste citochine potessero generare in vitro MDSC dai
precursori midollari.
53
Figura 1. Citochine coinvolte nella differenziazione e funzione delle MDSC.
(A) Rilascio delle citochine GM-CSF, IL-6 e G-CSF testato mediante ELISA nei surnatanti di differenti linee
tumorali. I risultati rappresentano la media ± SD della secrezione di citochina di tre esperimenti indipendenti.
(B) Analisi basata su gene-chip Affymetrix di cellule CD11b+ infiltranti il tumore isolate da differenti istotipi
tumorali; i dati sono espressi, su una scala logaritmica in base 2, come l’incremento medio dell’espressione genica
nelle cellule CD11b+ infiltranti il tumore comparate alle cellule CD11b+ isolate dalla milza di topi sani singenici.
Rappresentata la media di 3 chips indipendenti per gruppo (ciascun chip è stato ibridizzato con mRNA ottenuto da
cellule CD11b+ isolate da pool di 3 tumori o 9 milze); *** P≤0.001, ** P≤0.01, * P≤0.05, Student's t-test.
(C) Rilascio delle citochine GM-CSF, IL-6 e G-CSF testato mediante ELISA nei surnatanti di entrambe le frazioni
cellulari CD11b+ o CD11b- isolate dalle masse di differenti tumori inoculati sottocute. I risultati rappresentano la
media ± SD della secrezione delle citochine da tre esperimenti indipendenti.
54
Caratterizzazione delle MDSC indotte in vitro mediante trattamento con citochine.
L’induzione in vivo di MDSC mediata dal GM-CSF richiede solo tre o quattro giorni di
somministrazione della citochina (Bronte, Chappell et al. 1999; Bronte, Apolloni et al. 2000).
Questa informazione ci ha portato a pensare di poter indurre, in pochi giorni, la differenziazione
delle MDSC in vitro, a partire da cellule del midollo osseo grazie ad opportuni cocktail di
citochine. Le cellule di midollo osseo sono state coltivate per 4 giorni con GM-CSF, G-CSF, IL-6
o la combinazione di queste citochine; successivamente abbiamo monitorato l’induzione della
catena α dell’ IL-4R (CD124), la quale si è rivelata un componente chiave per l’attivazione del
programma soppressivo nelle MDSC (Gallina, Dolcetti et al. 2006; Serafini, Meckel et al. 2006;
Serafini, Mgebroff et al. 2008).
In parallelo abbiamo saggiato se le cellule del midollo osseo, trattate in vitro con le diverse
citochine, fossero in grado di sopprimere l’attività litica dei linfociti T CD8+(cellule CL4)
esprimenti un TCR transgenico specifico per l’emoagglutinina del virus dell’influenza (HA).
L’espressione dell’ IL-4Rα non è rilevabile nelle CD11b+/Gr-1+ del midollo fresco e queste
cellule non possiedono attività inibitoria quando aggiunte, in differenti concentrazioni, a CTL
stimolati con peptide HA, isolati da animali CL4 (Fig. 2, A e B). L'aggiunta delle singole citochine
IL-6 o G-CSF non cambia significativamente i livelli di espressione di IL-4Rα nelle cellule del
midollo osseo; inoltre, IL-6 diminuisce la vitalità cellulare prevenendo quindi la possibilità di
ulteriori caratterizzazioni funzionali. Nonostante l’incremento di espressione di IL-4Rα in seguito
al trattamento con G-CSF, questa citochina non induce alcuna apprezzabile funzione
immunosoppressiva nelle cellule del midollo. Il GM-CSF induce un significativo incremento
dell’espressione di IL-4Rα (P=0.028 vs BM fresco non trattato) e le cellule poste in coltura con
questa citochina inibiscono l’attività citotossica dei CTL in modo dose dipendente (Fig. 2, A e B).
L’aggiunta di combinazioni di GM-CSF+G-CSF e di GM-CSF+IL-6 alle cellule del midollo
osseo è in grado di generare cellule con aumentata positività per i marcatori CD11b e Gr-1, alti
livelli di espressione di IL-4Rα (P=0.0029 e P=0.0016 vs BM fresco non trattato, rispettivamente)
ed attività inibitoria significativa sui linfociti T CL4 attivati dall’antigene, anche a basse percentuali
di cellule. Analoghe attività inibitorie sono esercitate anche su CTL stimolati da allo antigeni in
colture MLR (dati non mostrati).
55
Figura 2. Cellule di midollo osseo stimolate da citochine esprimono IL-4Rα ed inibiscono la citotossicità
dei linfociti T indotta dall’antigene.
(A) L’accumulo delle cellule CD11b+/Gr-1+ e l’espressione di IL-4Rα nelle colture di BM dopo 4 giorni in presenza
di differenti citochine sono mostrati rispettivamente nei pannelli in contour ed in istogramma. Contour ed
istogrammi sono un risultato rappresentativo di nove esperimenti indipendenti, mentre la percentuale in countur del
quadrante e l’intensità media di (MFI) sono presentati come media ± SD di nove esperimenti indipendenti. Tutte le
comparazioni sono state effettuate tra BM trattato con le citochine vs BM fresco: *, P≤0.05; **, P≤0.01, Student’s ttest).
(B-C) Attività soppressiva, in vitro, delle MDSC quando vengono aggiunte come terza parte ad una coltura
leucocitaria mista stimolata dal peptide (MLPC), allestita con linfociti T CD8+ specifici per HA provenienti da topi
transgenici CL4 e stimolati in vitro con peptide HA512-520. Dopo 5 giorni, l’attività citotossica è stata testata in un
tipico test di rilascio di 51Cr a 5-h. Le cellule derivate o dal BM (B) o le CD11b+ sortate dalla milza di topi BALB/c
privi di tumore (C) trattate con le citochine per 4 giorni o ex vivo sono state aggiunte alla coltura MLPC a differenti
percentuali rispetto al numero totale delle cellule presenti nelle colture (12% , 6% and 3%). I dati sono stati espressi
come il rapporto tra le L.U.30 delle colture contenenti le MDSC e le colture di controllo allestite in assenza delle
MDSC. I risultati sono rappresentati come la media ± SD di 3 esperimenti indipendenti; tutte le comparazioni sono
riferite alle colture contenenti le MDSC vs le culture senza le MDSC: *, P≤0.05; **, P≤0.01, Student’s t-test.
56
Il fenotipo delle cellule CD11b+ arricchite dal midollo osseo, dopo trattamento con citochine, è
stato caratterizzato sia nei topi BALB/c che C57BL/6 (Fig. 3A e 3B, rispettivamente) e
comparato alle cellule CD11b+ del midollo fresco, o isolate dalle milze di topi inoculati con
tumori di diversa istologia.
Nonostante la presenza di alcune differenze, verosimilmente legate ai differenti background
genetici dei topi, abbiamo identificato due principali sottopopolazioni cellulari all’interno della
popolazione delle MDSC: cellule simili ai granulociti CD11b+/Gr-1high/CD62L+/F4/80+/- e
cellule più simili ai monociti CD11b+/Gr-1low/CD62L-/F4/80+ (Sica and Bronte 2007; Youn,
Nagaraj et al. 2008; Gabrilovich and Nagaraj 2009). Inoltre, anche le MDSC derivate dal BM dei
topi C57BL/6 hanno la capacità di inibire l’attività di linfociti T CD8+ specifici derivati da topi
transgenici p-mel-1 (Fig.3C).
Le cellule CD11b+ isolate dalla milza di topi sani trattate con le citochine descritte in precedenza
non sono in grado di acquisire le proprietà funzionali tipiche delle MDSC (Fig. 2C). Inoltre,
coltivando in vitro la totalità degli splenociti con le diverse citochine, sono state recuperate
pochissime cellule vitali (dati non mostrati). Questi dati permettono di affermare che le CD11b+
provenienti dalla milza di topi privi di tumore non comprendono precursori delle MDSC, che
invece risultano risiedere principalmente nel BM.
57
Figura 3. Comparazione fenotipica e funzionale tra le MDSC indotte dal tumore e quelle generate in vitro
dalle cellule del midollo osseo dopo trattamento con citochine.
L’espressione dei marcatori Gr-1, CD62L, CD11c, F4/80, Ly6C e Ly6G è stata valutata su cellule CD11b+.
(A) Dal pannello in alto al pannello in basso: profilo al FACS delle cellule di BM fresco dal BALB/c, cellule di BM
dal BALB/c trattato per 4 giorni con una combinazione di GM-CSF e G-CSF, cellule di BM dal BALB/c trattato
per 4 giorni con una combinazione di GM-CSF e IL-6 e cellule isolate dalla milza di topi portatori di tumore 4T1 e
C26-GM.
(B) Dal pannello in alto al pannello in basso: profilo al FACS delle cellule di BM fresco dal C57BL/6, cellule di BM
dal C57BL/6 trattato per 4 giorni con una combinazione di GM-CSF e G-CSF, cellule di BM dal C57BL/6 trattato
per 4 giorni con una combinazione di GM-CSF e IL-6 e cellule isolate dalla milza di topi portatori di tumore
MCA203.
In (A) e (B) è mostrato un risultato rappresentativo di 4 esperimenti indipendenti.
(C) Attività soppressiva in vitro delle cellule MDSC derivate dal BM dal topo C57BL/6, quando aggiunte a colture
MLPC allestite con linfociti T CD8+ specifici per gp100 provenienti da topi transgenici p-mel-1 stimolati in vitro con
il peptide gp10025-33. Dopo 5 giorni di coltura, l’attività citotossica è stata testate in un saggio di rilascio 51Cr a 5-h. Le
cellule derivate dal BM sono state aggiunte alla coltura MLPC a differenti percentuali rispetto al numero totale delle
cellule presenti nelle colture (12% , 6% and 3%). I dati sono stati espressi come il rapporto tra le L.U.30 delle colture
contenenti le MDSC e le colture di controllo allestite in assenza delle MDSC. I dati sono stati espressi come il
rapporto tra le L.U.30 delle colture contenenti le MDSC e le colture di controllo allestite in assenza delle MDSC. I
risultati sono rappresentati come la media ± SD di 3 esperimenti indipendenti; tutte le comparazioni sono riferite alle
colture contenenti le MDSC vs le culture senza le MDSC: *, P≤0.05; **, P≤0.01, Student’s t-test.
58
Attività immunoregolatorie delle MDSC differenziate dal BM del topo.
Abbiamo successivamente valutato la capacità delle MDSC indotte nelle colture di BM di
catturare gli antigeni tumorali e presentarli preferenzialmente alle cellulle FOXP3+/CD4+ T
regolatorie (Treg) come si è dimostrato per le MDSC indotte dai tumori (Huang, Pan et al. 2006;
Serafini, Mgebroff et al. 2008).
Il BM fresco e le MDSC, Thy1.2+, derivate dal BM dopo trattamento in vitro con citochine o
indotte dal tumore, sono state o meno pulsate con il peptide HA110-120 ristretto per classe II e cocoltivate con cellule T CD4+(Thy1.1+) congeniche HA-specifiche isolate da topi transgenici 6.5 e
marcate con CFSE, in presenza di splenociti BALB/c Thy1.2+ utilizzati come cellule feeder. In
mancanza della presentazione del peptide non è stata osservata alcuna proliferazione delle cellule
T CD4+ sia FOXP3+ (Treg) sia FOXP3- (Teff) (valutata dalla diluizione del CFSE, Fig. 4A).
Solamente le MDSC derivate dalla milza o da cellule del BM poste in coltura con le citochine, ma
non il BM fresco, sono in grado di presentare il peptide HA alle cellule T ed indurne la
proliferazione. Tale proliferazione era preferenzialmente a carico delle cellule Treg, poiché il 4757% delle cellule CSFElow erano FOXP3+ (Treg) mentre solo il 19-32% delle cellule CSFElow
erano FOXP3- e quindi Teff (Fig. 4A). Questi esperimenti non ci permettevano di stabilire se la
popolazione FOXP3+/CFSElow derivava dalla conversione di cellule Teff FOXP3- o dalla
espansione selettiva delle cellule Treg FOXP3+. Per monitorare la proliferazione delle cellule Treg
antigene-specifiche, abbiamo pertanto purificato, da topi 6.5 Thy1.1+, cellule CD4+/CD25+ HA e
le abbiamo marcate con CFSE e quindi mescolate in rapporto 1:10 con le cellule Teff CD4+ HA
specifiche ottenute tramite deplezione della frazione CD25+ dai topi 6.5 naïve. Le stesse
combinazioni, ma con i Teff marcati con CFSE e i Treg non marcati, sono state preparate per
monitorare la proliferazione delle cellule Teff. Le cellule Treg e Teff sono state quindi incubate
con cellule di BM fresco o MDSC pulsate con il peptide HA provenienti da topi Thy1.2+ in
presenza di splenociti totali BALB/c Thy1.2+ utilizzati come cellule feeder (Fig. 3B). Tutte le
preparazioni di MDSC, ma non il midollo fresco, inducono una robusta e preferenziale
proliferazione delle cellule Treg (Fig. 3B), supportando così il concetto che le MDSC mediano
l’espansione delle Treg a partire da una popolazione di cellule Treg naturalmente pre-esistente,
piuttosto che indurne la conversione da cellule T effettrici (Serafini, Mgebroff et al. 2008).
59
Figura 4. Funzioni immunoregolatorie delle MDSC derivate dal BM.
(A) Le MDSC (105 cellule) derivate dal BM o spleniche isolate dalla milza di topi BALB/c portatori del tumore C26GM sono state co-coltivate con un ugual numero di cellule CD4+/Thy1.1+/+/HA-specifiche marcate con CFSE e
purificate immuno-magneticamente dalle milze di topi transgenici 6.5, in presenza di 106 splenociti BALB/c
Thy1.2+/+ utilizzati come cellule feeder. MDSC-Thy1.2+/+ sono state pulsate o non pulsate con il peptide HA110-120.
Le cellule del BM isolate a fresco sono state utilizzate come controllo negativo. Dopo 60h, le colture sono state
marcate con gli Abs anti-CD4 ed anti-Thy1.1, permeabilizzate e poi marcate con l’Ab anti-FOXP3. I dot plots
rappresentati sono considerati all’interno della popolazione clonotipica delle cellule T. Sono riportati i dot plots e le
percentuali dei quadranti di un esperimento rappresentativo di 3 effettuati che hanno dato risultati analoghi.
(B) Cellule T CD4+/CD25+/Thy1.1+(Treg) HA-specifiche e cellule T CD4+/CD25-/Thy1.1+ (Teff) HA-specifiche
sono state mescolate nei rapporti 1:9 e sono state preparate differenti misture dove rispettivamente sono state
marcate con CFSE o le cellule Treg o le Teff per monitorare la loro proliferazione. Queste misture sono poi state cocoltivate con MDSC Thy1.2+/+, pulsate con peptide specifico HA110-120 e, dopo 72h, marcate con Abs anti-CD4 ed
anti-Thy1.1, e la proliferazione è stata determinate dalla diluizione del CFSE all’interno della popolazione clonotipica
considerate; gli istogrammi derivano da un esperimento rappresentativo e i dati sono la media± SD di tre esperimenti
indipendenti.
60
Le MDSC differenziate in vitro dal BM inducono tolleranza in vivo.
Allo scopo di valutare in vivo l’attività tollerogenica delle MDSC ottenute dal midollo in vitro,
abbiamo utilizzato un modello sperimentale nel quale linfociti T CD8+ antigene specifici
(Thy1.1+/+) naïve, provenienti da animali CL4, sono stati trasferiti in riceventi congenici
Thy1.2+/+. Dopo due giorni dal trasferimento, gli animali sono stati immunizzati tramite la
somministrazione di cellule dendritiche caricate con il peptide specifico HA512-520 MHC–ristretto
per classe I, e quindi inoculati con le cellule MDSC provenienti o dalla milza di topi con tumore
C26-GM o da colture di midollo, pulsate o meno con il peptide. Un secondo trasferimento di
cellule MDSC è stato ripetuto dopo 5 giorni dal primo inoculo. Dopo 10 giorni
dall'immunizzazione gli animali sono stati sacrificati e le cellule ottenute dai linfonodi drenanti
sono state stimolate in vitro per valutare il numero dei linfociti T CD8+ secernenti IFN-γ (Fig.
5A). Soltanto nei topi che hanno ricevuto MDSC derivate dalla milza degli animali con tumore o
MDSC derivate dal BM trattato con la combinazione di citochine GM-CSF+IL-6 è stata
riscontrata una significativa riduzione sia del numero di linfociti trasferiti (Thy1.1+), che del
numero di cellule secernenti IFN-γ tra i linfociti T CD8+. Inoltre, come precedentemente
descritto (Nagaraj, Gupta et al. 2007), l’attività tollerogenica delle MDSC risulta essere antigene
dipendente poichè il trasferimento di MDSC non pulsate con il peptide non induce alcuna
contrazione dei linfociti T CD8+ (Fig. 5C). Sembra quindi che, a dispetto delle similitudini
descritte in precedenza, i due trattamenti GM-CSF+G-CSF e GM-CSF+IL-6 inducano il
differenziamento di cellule MDSC con un diverso potenziale tollerogenico in vivo. Va comunque
puntualizzato che, anche considerando la soppressione in vitro, il trattamento GM-CSF+IL-6
induce il differenziamento di cellule MDSC con un’attività inibitoria più elevata su base cellulare
rispetto alle MDSC derivate dagli altri trattamenti come si evince dalla figura 2B. Una stretta
correlazione tra un' elevata attività soppressiva in vitro e l’abilità di indurre tolleranza in vivo è stata
recentemente dimostrata dal nostro gruppo per le MDSC indotte dal tumore (Dolcetti, Peranzoni
et al. 2009).
61
Figure 5. Attività tollerogenica in vivo delle MDSC differenziate dal BM in vitro.
(A) 4x106 cellule T CD8+ sono state isolate dalle milze di topi CL4 tramite separazione immunomagnetica e trasferite
i.v. in topi BALB/c naïve. Dopo due giorni, i topi sono stati inoculati i.v. con 4x106 MDSC differenziate dal BM in
vitro (con le combinazioni GM-CSF+GCSF e GM-CSF+IL-6) o con splenociti CD11b+ isolati dalla milza di topi
portatori di tumore C26-GM. Le MDSC sono state o meno pulsate con il peptide HA512-520. Le cellule del BM isolate
a fresco sono state utilizzate come controllo negativo. Lo stesso giorno, entro un’ora dal trasferimento delle MDSC, i
topi sono stati immunizzati con 4x105 DC murine caricate con il peptide HA512-520 ed attivate da LPS. Dopo 5 giorni
è stato ripetuto l'inoculo delle cellule MDSC., Dopo 12 giorni gli animali sono stati sacrificati e le cellule ottenute dai
linfonodi sono state ristimolate o con il peptide specifico o con il peptide di controllo. Dopo 24h, le cellule sono
state marcate con gli anticorpi anti-CD8 ed anti-Thy1.1, permeabilizzate, e successivamente marcate con anti-IFN-γ.
(B) I plots sono considerati all’interno della popolazione cellulare T clonotipica (CD8+/Thy1.1+). Ogni plot è
rappresentativo di un gruppo costituito da 6 animali.
(C) Il numero di cellule Thy1.1+/105 cellule CD8+ ed il numero di cellule secernenti IFN-γ/105 cellule CD8+ sono
state valutate mediante analisi al FACS. Gli istogrammi rappresentano la media ± SD di n=6 topi/gruppo
raggruppati da 2 esperimenti indipendenti. Nei gruppi pulsati con peptide, *, P< 0.05 per il gruppo NO MDSC vs
gruppo MDSC derivate da C26-GM e tra NO MDSC vs gruppo MDSC derivate da BM GM-CSF+IL-6.
62
Nonostante il trasferimento adottivo delle MDSC ottenute dal midollo confermasse le loro
proprietà immunoregolatore in vivo, abbiamo deciso di valutare anche la loro abilità tollerogenica a
lungo termine. A tale scopo abbiamo utilizzato un modello di allotrapianto di insule pancreatiche
effettuato in topi resi diabetici farmacologicamente (Fig. 6). In questo modello, i topi diabetici
sopravvivono a lungo se trapiantati con insule singeniche sotto la capsula renale, mentre il
trapianto allogenico è rigettato in circa 3-4 settimane (Fig. 7A). Il trasferimento adottivo ripetuto
(per un totale di quattro inoculazioni) di MDSC differenziate in vitro, singeniche al ricevente,
aumenta la percentuale di lungo-sopraviventi nel gruppo di topi trapiantati con insule allogeniche
in assenza di somministrazione di farmaci immunosoppressivi (Fig. 7A). Ancora una volta, in
accordo con i risultati descritti in precedenza, la somministrazione delle MDSC ottenute in vitro
con la combinazione di citochine GM-CSF+IL-6 induce un significativo aumento della
soppravvivenza rispetto al gruppo di controllo (animali non riceventi MDSC) (P<0.0001, Fig.7A).
Infatti circa il 75% dei topi trattati con le MDSC differenziate in vitro con GM-CSF+IL-6
rimangono normoglicemici ed in buona salute per l’intero periodo di osservazione di 200 giorni,
analogamente a tutti i topi di controllo trapiantati con insule singeniche. Al rigetto, o a tempi
prestabiliti dopo il trapianto, gli animali sono stati sacrificati per effettuare una valutazione
morfologica e fenotipica, mediante istologia ed immunoistochimica, dei reni contenenti le insule
trapiantate e dei pancreas al fine di valutare lo stato del trapianto (Fig. 7B). Il trapianto singenico
induce in tutti gli animali una forte positività della colorazione per l’insulina anche oltre i 200
giorni. I riceventi gli allotrapianti non trattati, sacrificati in seguito al raggiungimento dei livelli di
glucosio stabiliti, presentano insulite con un modesto infiltrato linfocitario di cellule T CD4+ e
CD8+, ed una colorazione debole o assente per l’insulina. In seguito a trattamento con MDSC, il
referto istologico varia tra il pieno rigetto (vedi MDSC differenziate con GM-CSF+G-CSF), e
una diffusa positività per la colorazione dell’ insulina in presenza di infiltrazione linfocitaria (vedi
MDSC differenziate con GM-CSF+IL-6). In quest’ultimo gruppo, l’infiltrato linfocitario (cellule
T CD4+ e CD8+) è confinato alle aree circostanti esterne al trapianto positive per insulina,
assimilabile ad un quadro istologico non compatibile con insulite (Fig. 7B). Inoltre, in questo
gruppo le insule infiltrate risultano normali e composte da cellule prive di segni di degenerazione
citoplasmatica o nucleare.
Per confermare che l’induzione della tolleranza fosse effettivamente indotta dagli alloantigeni
espressi sulle cellule delle insule abbiamo analizzato animali trapiantati con insule allogeniche e
trattati mediante 3 somministrazioni di MDSC differenziate in vitro con GM-CSF+IL-6. Dopo 3
settimane dal trapianto delle insule, i topi sono stati sacrificati e le cellule provenienti dalle milze e
dai linfonodi mesenterici sono state stimolate in vitro, per 5 giorni, con cellule delle insule
63
singeniche o allogeniche, disgregate meccanicamente, per stimolare la secrezione di IFN-γ da
parte delle cellule T attivate dall’antigene . I topi trapiantati con le insule allogeniche e non trattati
con MDSC montano una forte risposta contro gli alloantigeni delle insule, mentre i riceventi
trattati con le MDSC differenziate dal BM mostrano una risposta comparabile ai topi di controllo,
che non hanno ricevuto nè le MDSC nè il trapianto allogenico di insule (Fig. 7C). Non c’è
riconoscimento e quindi rilascio significativo di IFN-γ da parte degli splenociti e delle cellule dei
linfonodi che derivano dai topi che non hanno ricevuto alcun trapianto e da parte di quelli che
sono stati trapiantati con insule C57BL/6 e le cui cellule sono state ristimolate in vitro con le
insule scorrelate FVB. Questo esperimento indica che perché siano indotte cellule T in grado di
riconoscere in modo specifico gli alloantigeni presentati dalle insule è necessario che gli animali
abbiano subito l’allotrapianto con le stesse insule (Fig. 7C).
Ci siamo inoltre chiesti se i topi allotrapiantati ma lungo-sopravviventi perchè tollerizzati
dall’inoculo delle MDSC avessero un’ immuno-reattività compromessa anche verso alloantigeni
espressi su cellule diverse dalle insule con le quali erano stati immunizzati. A tale scopo, abbiamo
comparato in una classica MLR l’alloreattività degli splenociti dei topi lungo sopravviventi in
seguito a trapianto allogenico e somministrazione delle MDSC con quella dei topi trapiantati con
insule singeniche. Gli splenociti da questi due gruppi di animali sono stati stimolati con splenociti
γ-irradiati provenienti da topi C57BL/6 o FVB. Dopo 5 giorni l’attività citotossica delle colture è
stata rilevata effettuando un saggio di rilascio di 51Cr. I topi trapiantati con insule allogeniche e
trattati con MDSC provenienti dal midollo sviluppavano CTL pienamente funzionali sia contro
cellule target derivate dal ceppo C57BL/6 che FVB, così come i topi di controllo trapiantati con
insule singeniche (Fig. 7D). Questi dati, dunque, indicano che la somministrazione delle MDSC
dal BM non induce un’ immunosoppressione generalizzata poiché è stato mantenuto il
riconoscimento di alloantigeni presentati da splenociti.
64
.
Figura 6. Trasferimento adottivo di MDSC differenziate in vitro in un modello di trapianto allogenico di
insule pancreatiche. Rappresentazione schematica del protocollo per il trasferimento adottivo di MDSC in un
modello di trapianto sub-capsulare di insule. Ai topi riceventi BALB/c è stata somministrata una doppia dose di 150
mg/kg di Streptozotocina (STZ) tramite iniezione i.p ogni sette giorni,, allo scopo di indurre il diabete. La glicemia è
stata monitorata ogni due giorni. All'instaurarsi del diabete (glicemia>250mg/dL) i topi sono stati trapiantati con
insule pancreatiche singeniche o allogeniche sotto la capsula del rene sinistro. Gruppi di topi trapiantati con insule
allogeniche hanno quindi ricevuto i.v. il trasferimento adottivo di 10 x 106 cellule MDSC singeniche differenziate in
vitro dal BM. Il trasferimento adottivo delle MDSC è stato effettuato una volta alla settimana e ripetuto per le tre
settimane successive. La glicemia dei topi trapiantati è stata misurata ogni 2 giorni e gli animali sono stati sacrificati
quando questo parametro era più elevato di 250 mg/dL per due misure consecutive.
65
Figura 7. Effetto terapeutico del trasferimento adottivo delle MDSC differenziate in vitro nel mantenimento
del trapianto allogenico di insule pancreatiche.
(A) L’attività tollerogenica delle MDSC è stata valutata nel modello allogenico di trapianto sub-capsulare di insule in
topi resi diabetici. Viene riportata la sopravvivenza dei riceventi in termini di giorni dal trapianto. Il sacrificio degli
animali è stato effettuato quando la glicemia superava per due volte consecutive il valore di 250 mg/dL. Sono
riportati vari gruppi di trattamento (riceventi l’allotrapianto trattati con MDSC GM-CSF+G-CSF n=10; riceventi
l’allotrapianto trattati con MDSC GM-CSF+IL-6 n=20; riceventi l’allotrapianto non trattati di controllo n=23; i
controlli riceventi il trapianto singenico n=11, il numero di animali di ciascun gruppo è l’insieme degli animali di 3
esperimenti indipendenti messi insieme; ***, P≤0.001, comparando: il gruppo allotrapiantati trattati con MDSC GMCFS + IL-6 vs allotrapiantati non trattati di controllo; tutte le altre comparazioni non sono risultate significative;
Kaplan-Maier LogRank test).
(B) Analisi immunoistochimica dei reni contenenti il trapianto di insule da animali appartenenti ai diversi gruppi di
trattamento. Le immagini riportate (ingrandimento60X) si riferiscono ad un esempio rappresentativo per ciascun
gruppo di trattamento.
(C) I topi riceventi BALB/c sono stati trapiantati con insule pancreatiche isolate da topi allogenici C57BL/6.
Gruppi di topi trapiantati con insule allogeniche hanno ricevuto anche il trasferimento adottivo di MDSC derivate
66
dal BM generate con GM-CSF+ IL-6. Come controllo di risposta naïve, sono stati inclusi anche topi non trapiantati.
Dopo 3 trattamenti con le MDSC, i topi sono stati sacrificati e sia gli splenociti che le cellule dei linfonodi
mesenterici di ciascun animale sono state ristimolate con insule digerite provenienti sia da topi BALB/c, C57BL/6 o
FVB. Dopo cinque giorni di stimolazione, l’IFN-γ rilasciato in coltura dai linfociti co-coltivati con le insule disgregate
è stato saggiato mediante test ELISA. Gli istogrammni rappresentano la media ± SD delle differenze tra gli stessi
campioni stimolati sia con le insule allogeniche che con quelle singeniche; n= 3 topi/gruppo, sono stati effettuati 2
esperimenti indipendenti con risultati simili; *, P≤0.05, Student’s t-test. (D) I topi BALB/c trapiantati con insule
singeniche o allogeniche e trattati con MDSC derivate dal BM (GM-CSF+IL-6), sono stati sacrificati dopo 200 giorni
dal trapianto e le milze utilizzate come responders in colture MLR contro splenociti allogenici stimolatori γ-irradiati
provenienti sia da topi C57BL/6 o FVB. Dopo 5 giorni, l’attività citotossica delle colture MLR è stata testata in un
tipico saggio a 5h di 51Cr rilasciato da cellule target sia singeniche (BALB/c) che allogeniche (C57BL/6 o FVB).
Rappresentazione della media ± SD,
n=3 topi/gruppo, di un esperimento rappresentativo di 2 esperimenti
indipendenti.
67
Il fattore trascrizionale C/EBPβ è indispensabile per il programma immunosoppressivo
delle MDSC differenziate in vitro dal BM o indotte dal tumore.
L'analisi dei profili di espressione di geni sovra-espressi e sotto-regolati delle cellule CD11b+
differenziate in vitro o purificate immuno-magneticamente dalla milza e dalla massa tumorale, di
topi portatori di neoplasie di diversa istologia, ha evidenziato che le cellule CD11b+ intratumorali
clusterizzano in un braccio del dendrogramma con le cellule differenziate in vitro dalle
combinazioni GM-CSF+G-CSF e GM-CSF+IL-6, mentre le CD11b+ isolate dagli splenociti di
animali sani o portatori di tumore clusterizzano con le CD11b+ ricavate dal BM fresco nell’altro
braccio (Fig. 8A e B). Questo dato suggerisce un'importante somiglianza tra le MDSC
differenziate in vitro e le cellule CD11b+ infiltranti il tumore. Un programma trascrizionale
condiviso appare quindi legare le MDSC differenziate in vitro e quelle presenti nel sito tumorale.
Nel tentativo di identificare un possibile bersaglio molecolare per GM-CSF ed IL-6, implicate
come descritto in precedenza nella regolazione della mielopoiesi, abbiamo focalizzato la nostra
attenzione sulla famiglia dei fattori trascrizionali C/EBP. In particolare, mentre C/EBPα è il
principale regolatore della granulopoiesi nello stato “steady state”, C/EBPβ controlla la
granulopoiesi di emergenza indotta da citochine ed infezioni (Hirai, Zhang et al. 2006).
Figura 8. Cluster gerarchico delle MDSC indotte dal tumore o differenziate in vitro da BM in presenza di
citochine.
(A) Dendrogramma riassuntivo dell'analisi gene-chip Affymetrix delle cellule CD11b+ ottenute da:
infiltrato
tumorale e milza di topi portatori di tumore C26-GM, milza di topi sani, cellule del BM ex vivo e dopo trattamento
per quattro giorni con la combinazione di citochine GM-CSF+IL-6 o GM-CSF+G-CSF. Il cluster gerarchico è stato
effettuato utilizzando 74 geni selezionati col metodo RankProd confrontando le cellule CD11b+ intratumorali e le
cellule CD11b+ spleniche da topi privi di tumore, ad un fpf ≤0.0005. La barra con la scala di colori rappresenta la
variazione relativa di espressione genica. Il dendrogramma è stato generato utilizzando un algoritmo di
raggruppamento gerarchico basato sul coefficiente di correlazione di Pearson e associazione media.
(B) Il clustering gerarchico è stato effettuato utilizzando 115 geni selezionati col metodo RankProd confrontando le
cellule CD11b+ intratumorali e le cellule CD11b+ spleniche da topi sani ad un fpf ≤0.001.
68
69
Sono stati ibridizzati tre chips indipendenti per ciascun gruppo.
Nel tentativo di identificare un possibile bersaglio molecolare per GM-CSF ed IL-6, implicate
come descritto in precedenza nella regolazione della mielopoiesi, abbiamo focalizzato la nostra
attenzione sulla famiglia dei fattori trascrizionali C/EBP. In particolare, mentre C/EBPα è il
principale regolatore della granulopoiesi nello stato “steady state”, C/EBPβ controlla la
granulopoiesi di emergenza indotta da citochine ed infezioni (Hirai, Zhang et al. 2006).
Ci siamo quindi chiesti se C/EBPβ potesse giocare un ruolo nello sviluppo e nella
differenziazione delle MDSC. C/EBPβ presenta tre isoforme con differente peso molecolare: la
proteina inibitoria del fegato (LIP), la proteina attivante del fegato (LAP), e la forma attivante del
fegato full-length (LAP*) (Qiu, Aiken et al. 2008). L'analisi mediante western blot ci ha permesso
di identificare le tre isoforme di C/EBPβ nelle CD11b+ intratumorali provenienti da quattro
neoplasie di diversa istologia e background genetico (H-2b e H-2d) mentre solo le CD11b+
spleniche di aplotipo H-2b presentano l'espressione della proteina. (Fig. 9A, pannello superiore).
Inoltre, mentre C/EBPβ è appena detectabile nelle CD11b+ del midollo fresco l’esposizione in
vitro alla combinazione di GM-CSF + IL-6 ne determina una up-regolazione nel tempo, anche se
permangono alcune differenze legate al background murino: infatti, mentre le tre isoforme sono
tutte indotte nel background C57BL/6 (Fig 9A, blot in basso a sinistra), LIP e LAP prevalgono
nel background BALB/c (Fig. 9A, blot in basso a destra).
Per capire il ruolo funzionale in vivo del fattore trascrizionale C/EBPβ, abbiamo generato un
modello murino di topi C/EBPβ knock out tessuto-ristretto. Il gene C/EBPβ è stato eliminato in
tutte le cellule del lineage ematopoietico utilizzando il ceppo deletore B6.Cg-Tg(Tek-Cre)1Ywa
(Tek ora chiamato Tie2; transgene abbreviato qui come Tie2Cre), già utilizzato in precedenti studi
per la delezione di altri geni (El Kasmi, Qualls et al. 2008). Abbiamo quindi isolato le cellule di
midollo osseo da topi wild type (+/+), eterozigoti c/ebpβ/flox/+;Tie2Cre (+/-) e knock out
c/ebpβflox/flox;Tie2Cre (-/-) e le abbiamo trattate in vitro con la combinazione GM-CSF+IL-6 per
generare cellule immunosoppressive MDSC. L’analisi mediante western blot delle MDSC così
ottenute
conferma la perdita o la riduzione di espressione di C/EBPβ nelle cellule
rispettivamente dei topi knock out ed eterozigoti (Fig. 9B). Solamente alla perdita completa di
C/EBPβ (confermata dal western blot) ha corrisposto la perdita completa del programma
immunosoppressivo delle MDSC nei riguardi delle cellule T CD8+ attivate dall’antigene (Fig. 9B).
Questo dato è stato confermato anche in vivo ed infatti i topi c/ebpβflox/flox;Tie2Cre (-/-) portatori di
tumore MCA203 mostrano una notevole diminuzione dell’ accumulo di cellule CD11b+/Gr-1+
nella milza rispetto ai topi wild type. Gli splenociti CD11b+ comunque isolati dalla milza di questi
70
animali non sono in grado di inibire in vitro l'attività effettrice dei linfociti T CD8+ antigene
specifici (Fig. 9C). Interessante è stata l'osservazione che sia la percentuale (Fig. 9D) che il
numero totale (dati non mostrati) di cellule CD11b+ nella milza di topi portatori di tumore è
significativamente ridotta solo nel ceppo c/ebpβflox/flox;Tie2Cre (-/-) e non negli animali eterozigoti
c/ebpβflox/+;Tie2Cre (+/-). In un lavoro recente del nostro gruppo, abbiamo dimostrato che tra le
cellule CD11b+/Gr-1+ indotte nella milza dal tumore, le sottopopolazioni cellulari CD11b+/Gr1int and CD11b+/Gr-1low ma non le CD11b+/Gr-1high possiedono attività immunoregolatoria sui
linfociti T CD8+, sia in vitro che in vivo (Dolcetti, Peranzoni et al. 2009). Abbiamo quindi valutato
se la delezione di C/EBPβ potesse indurre dei cambiamenti significativi nella distribuzione delle
diverse sottopopolazioni. L'analisi citofluorimetrica delle sottopopolazioni di cellule CD11b+/Gr1+ nei differenti ceppi considerati ha evidenziato che la percentuale delle cellule CD11bhigh/Gr1high e CD11bhigh/Gr-1- risultano diminuite sia nei topi eterozigoti che in quelli knock out per
C/EBPβ, mentre le sottopopolazioni caratterizzate da bassa ed intermedia espressione di Gr-1,
immunosoppressive risultano significativamente diminuite solo nei topi knock out (Fig. 9D).
Alla luce di quanto descritto, si è voluto indagare il ruolo di C/EBPβ nella tolleranza indotta dal
tumore in vivo. Abbiamo quindi inoculato le cellule tumorali EG-7, che esprimono l'antigene
ovalbumina (OVA), sottocute in topi c/ebpβflox/+;Tie2Cre (+/-) e c/ebpβflox/flox;Tie2Cre (-/-).
Similmente a quanto descritto per il modello di fibrosarcoma MCA203, anche il modello
tumorale EG-7 induce cellule CD11b+ infiltranti il tumore che esprimono C/EBPβ (isoforma
LAP*) e tale espressione viene persa nei topi C/EBPβ knock out (Fig. 10, pannello a destra).
Dopo 7 giorni dall'inoculo del tumore i topi portatori del tumore EG-7 o inoculati con PBS
(gruppo di controllo), sono stati trasferiti i.v. con linfociti T CD8+ specifici per OVA, (purificati
tramite separazione immunomagnetica da topi trasgenici OT-1). Gli animali sono stati sacrificati
dopo 7 giorni dal trasferimento dei CD8+-OVA specifici, e le cellule ottenute dalla disgregazione
meccanica dei linfonodi sono state ristimolate in vitro sia con il peptide OVA specifico sia con il
peptide di controllo. Rispetto agli animali privi di tumore (inoculati con PBS) i topi portatori di
tumore c/ebpβflox/+;Tie2Cre (+/-) presentano un ridotto numero di linfociti T CD8+ OT-1 in grado
di rispondere alla stimolazione con il peptide specifico, come mostrato dal numero di spot
secernenti IFN-γ rilevati dal saggio ELISPOT (Fig.10 pannello a sinistra). La perdita di effettori
specifici per OVA è recuperata significativamente nei topi c/ebpβflox/flox;Tie2Cre (-/-) in assenza dell’
effetto immunosoppressivo determinato dalle MDSC (P=0.0016, Fig. 10). Questo dato suggerisce
che C/EBPβ, poiché controlla l’accumulo e l’attività delle MDSC, è un fattore chiave in vivo nella
regolazione della tolleranza indotta dal tumore verso i propri antigeni.
71
Abbiamo infine valutato se l’assenza di C/EBPβ revertendo la tolleranza indotta dal tumore,
potesse incrementare l'efficacia terapeutica di un approccio immunoterapico quale il
trasferimento adottivo di CTL antigene specifici. Per utilizzare un bersaglio clinicamente
rilevante, abbiamo trasferito CTL policlonali che riconoscono l’antigene telomerasi murina
(Mennuni, Ugel et al. 2008; Ugel, Scarselli et al. 2009) secondo lo schema riportato in Fig.11A. Il
trasferimento adottivo dei CTL mTERT specifici in topi wild-type portatori del fibrosarcoma
MCA203 non ha effetti terapeutici in assenza di una precedente mielo-linfo deplezione (Fig.
11B), essenziale per l'ottimizzazione del trasferimento come riportato dalla letteratura (Gattinoni,
Powell et al. 2006; Ugel, Scarselli et al. 2009). Infatti solo la combinazione della mielo-linfo
deplezione con un successivo trasferimento di CTL mTERT specifici è in grado di indurre un
significativo incremento della soppravvivenza degli animali portatori di tumore in confronto al
gruppo di controllo (animali portatori di tumore e trattati con un CTL specifico per l'antigene βgal). La procedura descritta, tuttavia non è in grado di determinare la regressione completa del
tumore. Al contrario, anche in assenza di mielo-linfo deplezione, il trasferimento adottivo dei
CTL mTERT specifici è in grado di indurre un significativo prolungamento della sopravvivenza
ed una completa cura in più del 60% dei topi c/ebpβflox/flox;Tie2Cre (-/-) mentre non ha alcun
impatto sulla progressione tumorale nei topi eterozigoti c/ebpβflox/+;Tie2Cre (+/-)(Fig. 11B).
72
Figura 9. Il fattore trascrizionale C/EBPβ è coinvolto nell’attività soppressiva delle cellule MDSC in vitro.
(A) Immunoblot per C/EBPβ su: cellule CD11b+ isolate dalle milze e tumori di topi portatori di differenti tipi di
tumori (panello superiore, uno rappresentativo di 3 esperimenti indipendenti); cellule del BM fresco e delle cellule di
BM trattato con le citochine GM-CSF+IL-6 per 12, 24, 48,72 e 96 h, isolate sia da topi BALB/c o C57BL/6
(pannelli in basso, uno rappresentativo di 3 esperimenti indipendenti). Sono indicati i pesi molecolari delle 3
differenti isoforme di C/EBPβ (LAP*=38 KD; LAP=34 KD; LIP=20 KD).
(B) L’attività soppressiva in vitro delle MDSC ottenute dal BM di topi C57BL/6, c/ebpβflox/+;Tie2Cre e
c/ebpβflox/flox;Tie2Cre è stata valutata aggiungendo le cellule MDSC differenziate in percentuali crescenti alle colture
MLPC allestite con linfociti T CD8+ specifici per l'antigene gp100, ottenuti da topi transgenici p-mel-1, stimolati con
il peptide specifico gp10025-33. Dopo 5 giorni, l’attività citotossica delle colture è stata testata in un saggio di rilascio di
51Cr
a 5-h. I dati sono espressi come rapporto tra le L.U.30 delle colture contenenti le MDSC e le L.U.30 delle colture
di controllo allestite in assenza delle MDSC. Gli istogrammi rappresentano la media ± SD, di n=3 colture
indipendenti /gruppo, risultato rappresentativo di 3 esperimenti indipendenti con simili risultati; tutte le
comparazioni sono tra le colture contenenti le MDSC vs colture senza le MDSC: *, P≤0.05; **, P≤0.01, Student’s ttest,). Le cellule del BM trattate con GM-CSF+IL-6 utilizzate nei saggi funzionali sono state valutate in immunoblot
per l’espressione di C/EBPβ, ed è mostrato un risultato rappresentativo di tre esperimenti indipendenti.
(C) Cellule CD11b+/Gr-1+ indotte dal fibrosarcoma MCA203 nei topi C57BL/6, c/ebpβflox/+;Tie2Cre and
c/ebpβflox/flox;Tie2Cre. Viene mostrato un contour plot rappresentativo per gruppo dell’accumulo splenico per uno dei 4
esperimenti indipendenti effettuati. L’attività soppressiva delle cellule CD11b+ isolate dalla milza degli animali
inoculati con tumore è stata saggiata aggiungendo le cellule a colture MLPC allestite come riportato al punto
precedente. L’attività soppressiva in vitro è stata testata ed i dati sono espressi come il rapporto tra le L.U.30 nelle
colture contenenti le MDSC e le colture di controllo allestite in assenza delle MDSC. Gli istogrammi rappresentano
la media ± SD di 4 esperimenti indipendenti, tutti i confronti riportati sono tra le colture contenenti le MDSC vs le
colture senza MDSC: **, P≤0.01, Student’s t-test.
(D) Accumulo delle sottopopolazioni di cellule CD11b+ nella milza dei topi C57BL/6,
c/ebpβflox/+;Tie2Cre
ec/ebpβflox/flox;Tie2Cre portatori del sarcoma MCA203. La percentuale totale di cellule CD11b+ e le percentuali delle
sottopopolazioni sono state calcolate sul totale degli splenociti. Gli istogrammi rappresentano la media ± SD di tre
esperimenti indipendenti (n=6 topi in totale, tutti i confronti sono tra c/ebpβflox/+;Tie2Cre e c/ebpβflox/flox;Tie2Cre vs
C57BL/6: *, P≤0.05; **, P≤0.01, Student’s t-test,).
73
Figura 10. Il fattore trascrizionale C/EBPβ è coinvolto nell’attività soppressiva delle MDSC in vivo.
I topi c/ebpβ flox/+;Tie2Cre and c/ebpβflox/flox;Tie2Cre sono stati inoculati s.c. sia con PBS (in assenza di tumore) o con la
linea tumorale EG-7. Dopo 7 giorni gli animali sono stati inoculati i.v. con le cellule T CD8+ OVA-specifici ottenuti
da topi OT-1. Dopo 7 giorni dal trasferimento dei linfociti antigne specifici, i topi sono stati sacrificati e le cellule dei
linfonodi sono state ristimolate in vitro con i peptidi OVA o β-gal ed analizzate per la produzione di IFN-γ mediante
il saggio ELISPOT. I dati sono riportati come differenza tra il numero di spots delle cellule poste in coltura con il
peptide specifico ed gli spots delle cellule poste in coltura con il peptide di controllo per milione di cellule. Gli
istogrammi rappresentano la media ± SD di n=6 topi/gruppo che rappresentano l’insieme di due esperimenti
separati; ** P≤0.01, c/ebpβflox/+; Tie2Cre vs c/ebpβflox/flox; Tie2Cre nei topi portatori di tumore; analisi mediante
immunoblot delle cellule CD11b+ della milza o infiltranti il tumore dei topi c/ebpβflox/+; Tie2Cre and c/ebpβflox/flox;
Tie2Cre inoculati con il tumore EG-7; l’immagine è rappresentativa di due blots.
74
Figura 11. L’assenza del fattore trascrizionale C/EBPβ nelle cellule ematopoietiche permette di
incrementare l'efficacia terapeutica del trasferimento di CTLs antigene specifici.
(A) Topi C57BL/6, c/ebpβflox/+;Tie2Cre, e c/ebpβflox/flox;Tie2Cre, sono stati inoculati s.c. con il tumore MCA203. Dopo
14 giorni, i topi sono stati trasferiti con CTL specifici per gli antigeni mTERT o β-gal (gruppo di controllo) stimolati
in vivo con la somministrazione dell’antigene e di IL-2. Un gruppo di topi C57BL/6 prima del trasferimento adottivo
di CTL mTERT sono stati linfodepletati mediante γ-irradiazione (5 Gy).
(B) Le curve indicano, per ciascun ceppo, la percentuale di topi che sopravvivono nel tempo dopo il trasferimento
adottivo dei CTL mTERT o β-gal (n=6 topi/gruppo, cumulati da due esperimenti indipendenti; i confronti sono
stati effettuati con Kaplan-Maier LogRank test).
75
C/EBPβ nelle MDSC infiltranti il tumore controlla l’espressione di enzimi che bloccano
l’attivazione delle cellule T.
Dopo aver stabilito che l’assenza di C/EBPβ elimina l’attività tollerogenica delle MDSC
spleniche, abbiamo valutato se C/EBPβ potesse influenzare anche il microambiente tumorale.
Sorprendentemente, abbiamo osservato poche differenze nel numero e nella distribuzione delle
cellule CD11b+ infiltranti il tumore tra i ceppi wild type (+/+), eterozigoti c/ebpβ/flox/+;Tie2Cre
(+/-) e knock out c/ebpβflox/flox;Tie2Cre (-/-) (dati non mostrati). Tuttavia, tramite analisi in western
blot di cellule CD11b+ infiltranti il tumore MCA203 abbiamo evidenziato come la perdita di
C/EBPβ causi una significativa riduzione di arginasi 1 (Arg1) e ossido nitrico sintetasi 2 (Nos2),
enzimi che sono stati descritti come componenti cruciali del macchinario inibitorio delle MDSC
(Bronte and Zanovello 2005; Gabrilovich and Nagaraj 2009) (Fig. 12A). Oltre ad Arg1 e Nos2
sono stati individuati anche altri geni, quali Arg2, Nos1 e Nos3, e componenti dell’ ossidasi
fagocitica (Cyba and Cybb), che sembrano contribuire all’abilità delle MDSC di impedire
l’attivazione e la proliferazione dei linfociti T (Bronte, Kasic et al. 2005; Nagaraj, Gupta et al.
2007). Un’analisi effettuata, mediante Real Time PCR, ha evidenziato che l’mRNA codificante
questi enzimi risultata essere down-regolato nelle cellule CD11b+ isolate dai topi portatori di
tumore c/ebpβflox/flox;Tie2Cre (-/-) rispetto ai topi eterozigoti c/ebpβflox/+;Tie2Cre (+/-), con la sola
eccezione di Arg2, che non è stata individuata nelle cellule CD11b+ associate al tumore (Fig. 12B).
Questi dati suggeriscono che la mancanza di C/EBPβ contribuisce a creare un microambiente
tumorale permissivo per la proliferazione dei linfociti T.
Poiché Nos2 in background C57BL/6 è cruciale nella soppressione indotta dalle MDSC
(Mazzoni, Bronte et al. 2002; Serafini, Meckel et al. 2006), abbiamo comparato l’attività inibitoria
degli splenociti CD11b+ isolati da topi portatori di tumore e le MDSC indotte in vitro dal BM, sia
da topi wild type che da Nos2 knock out. L’assenza di Nos2 su entrambe le popolazioni di
MDSC causa la perdita della loro attività immunosoppressiva sulle cellule T CD8+ attivate
dall’antigene (Fig. 12C), confermando ulteriormente che queste cellule utilizzano meccanismi
molecolari simili per inibire l’attivazione delle cellule T.
76
Figura 12. C/EBPβ è il principale regolatore degli enzimi coinvolti nei meccanismi di soppressione dei
linfociti attuati dalle cellule mieloidi nel sito tumorale.
(A) Immunoblot per C/EBPβ, Arg1 e Nos2 delle cellule CD11b+ isolate dai tumori di topi wild type C57BL/6,
c/ebpβflox/+;Tie2Cre, e c/ebpβflox/flox;Tie2Cre inoculati con il sarcoma MCA203 (gli istogrammi rappresentano la media ±
SD della scansione densitometrica da 3 diversi esperimenti normalizzati per l’actina; *, P<0.05; **, P≤0.01, Student’s
t-test).
(B) Valutazione mediante PCR quantitativa dei geni noti per essere coinvolti nei meccanismi immunosoppressivi
utilizzati dalle MDSC. I dati sono espressi, in scala logaritmica base 2, come l’incremento in fold change dell’ mRNA
dei diversi geni negli splenociti CD11b+ isolati dai topi c/ebpβflox/+;Tie2Cre e c/ebpβflox/flox;Tie2Cre portatori di tumore
MCA203, normalizzati per l’espressione del gene housekeeping GAPDH e paragonati all’espressione nel topo
portatore di tumore wild type C57BL/6. Gli istogrammi rappresentano la media ± SD, n=3 topi individuali/gruppo
di un esperimento rappresentativo di due.
(C) L’attività soppressiva esercitata da cellule derivate dal BM sia di topi wild type C57BL/6 sia di topi Nos2-/-,
trattate con GM-CSF+IL-6, o di cellule CD11b+ isolate dalla milza di topi portatori di tumore MCA203 sia C57BL/6
che Nos2-/- è stata valutata aggiungendo queste cellule come terza parte a colture MLPC. Le colture sono state
allestite utilizzando linfociti T CD8+ specifici per il peptide gp100, stimolati in vitro con il peptide specifico gp1002533,
provenienti da topi transgenici p-mel-1,. Dopo 5 giorni, l’attività citotossica dei linfociti presenti nelle colture è
stata testata mediante saggio di rilascio di
51Cr.
I dati sono espressi come rapporto tra le L.U.30 delle colture
contenenti MDSC e delle colture di controllo allestite in assenza delle MDSC. È riportata la media ± SD di tre
esperimenti indipendenti, tutte le comparazioni sono tra le colture contenenti le MDSC vs le colture prive di MDSC:
**, P≤0.01, Student’s t-test.
77
78
DISCUSSIONE
Nella prima parte di questo lavoro abbiamo fornito numerose evidenze che indicano come le
MDSC murine possano essere generate in vitro grazie ad un sistema di coltura semplice e di breve
durata in presenza di una combinazione di alcune citochine, normalmente rilasciate nel
microambiente tumorale. Questi dati confermano e supportano ulteriormente il legame esistente
tra MDSC e infiammazione (Gallina, Dolcetti et al. 2006; Sica and Bronte 2007; Cheng, Corzo et
al. 2008). Nonostante siano indotte da stimoli infiammatori, le MDSC ottenute in vitro dal midollo
osseo, analogamente alle MDSC indotte dal tumore, esercitano potenti attività antinfiammatorie e
immunoregolatorie, che comprendono la soppressione dei lifociti T CD8+ e l’induzione della
proliferazione di cellule Treg antigene specifiche. I nostri dati quindi supportano un ruolo delle
MDSC nel limitare le conseguenze di prolungate ed eccessive risposte immunitarie (Bronte and
Zanovello 2005; Marigo, Dolcetti et al. 2008; Gabrilovich and Nagaraj 2009).
Le MDSC ottenute in vitro esercitano un effetto ridotto sul rilascio dell’ IFN-γ da parte dei
linfociti T (Fig.5), e ciò conferma i nostri dati precedenti, suggerendo che l’ IFN-γ è richiesto per
l’attività delle MDSC contro i linfociti T CD8+ (Gallina, Dolcetti et al. 2006; Dolcetti, Peranzoni
et al. 2009), verosimilmente attraverso l’attivazione di Nos2 (Fig. 12). Comunque, in vivo, le
MDSC inducono una diminuzione del numero dei linfociti T CD8+ antigene specifici secernenti
IFN-γ, diminuzione dovuta per lo più alla scomparsa o alla mancanza di priming dei linfociti T
antigene specifici piuttosto che dalla minor produzione di IFN-γ (Fig.5), come è stato
recentemente mostrato in altri modelli tumorali (Dolcetti, Peranzoni et al. 2009).
I ruoli pro-tumorali ed immunoregolatori delle citochine GM-CSF e G-CSF sono diventati
evidenti negli anni scorsi. Si è osservato che il GM-CSF è prodotto da circa un terzo delle linee
cellulari tumorali umane (includendo cancro della mammella, della cervice uterina, della prostata,
del colon, del rene e melanoma) (Bronte, Chappell et al. 1999), ed è anche rilasciato da molte
linee cellulari murine quali il carcinoma a cellule squamose (Smith, Chen et al. 1998),
l’adenocarcinoma mammario e del colon (Bronte, Chappell et al. 1999), e il plasmocitoma
(Merchav, Apte et al. 1987).
Il G-CSF rilasciato dal tumore promuove il reclutamento di cellule CD11b+/Gr1+ con proprietà
pro-angiogeniche dipendenti in parte dalla produzione della proteina Bv8 piuttosto che dal
VEGF (Shojaei, Wu et al. 2007; Shojaei, Wu et al. 2007). Il trattamento con anticorpi anti-Bv8,
infatti, riduce il numero di cellule CD11b+/Gr1+ sia nel sangue periferico che nei tumori (Shojaei,
Wu et al. 2007). indicando come il Bv8 possa essere considerato un fattore addizionale per la
maturazione delle MDSC. Non è tuttavia ancora stato stabilito se le cellule CD11b+/Gr1+ con
attività pro-angiogenica siano anche immunosoppressive o se esistano sottopopolazioni cellulari
79
con attività differenti. Questo appare essere un punto importante da stabilire, considerando che
l’inoculazione in vivo di G-CSF induce cellule CD11b+/Gr1+ prive di attività immunoregolatoria
(Dolcetti, Peranzoni et al. 2009).
Un paradosso interessante è rappresentato dal fatto che il GM-CSF può indurre da solo l’intero
spettro dei cambiamenti mieloidi che portano all’accumulo delle MDSC quando viene
somministrato in vivo (Bronte, Chappell et al. 1999; Bronte, Apolloni et al. 2000), ma non quando
è usato in vitro come singola citochina differenziativa su cellule del midollo osseo.
Tuttavia, topi sottoposti ad un ciclo di inoculazioni di tre giorni con GM-CSF presentavano
anche aumentati livelli sierici di IL-6. Tale aumento non si osserva in topi deleti del gene per
C/EBPβ, dove i livelli sierici di IL-6 rimangono bassi (dati non mostrati). Non abbiamo tuttavia
identificato gli organi dove questa citochina viene prodotta anche se l’ipotesi è che siano fegato e
milza.
Un crescente numero di evidenze suggeriscono che l’IL-6 potrebbe essere rilasciata precocemente
durante lo sviluppo tumorale. L’ IL-6 è una citochina pleiotropica che regola la risposta
immunitaria, ma anche la proliferazione cellulare e l’apoptosi (Kishimoto 2005). Alti livelli di IL6, associati con una prognosi infausta, sono stati misurati in leucemie, linfomi, mielomi multipli,
melanomi, così come nel tumore della mammella, del polmone, dell’ovaio, delle cellule renali e
del pancreas (Trikha, Corringham et al. 2003). Studi recenti suggeriscono che la capacità di
produrre IL-6 in maniera autocrina sia un evento cruciale nella tumorigenesi, poiché tale
citochina supporta l’attivazione oncogenica di STAT3 nell’adenocarcinoma del polmone e la via
di segnalazione di Jagged-1/Notch nel carcinoma mammario (Gao, Mark et al. 2007; Sansone,
Storci et al. 2007). Inoltre, durante le prime fasi dello sviluppo del cancro associato alla colite,
l’IL-6 è prodotta dalla lamina propria e dalle cellule mieloidi derivate dal midollo osseo ed agisce
come promotore tumorale aumentando da un lato la proliferazione cellulare dei primi cloni
tumorali e dall’altro proteggendo le cellule dell’epitelio intestinale premaligne dall’apoptosi
(Grivennikov, Karin et al. 2009). Macrofagi e cellule dendritiche, che possono essere attivati da
segnali molecolari di “pericolo” prodotti dalle cellule tumorali morenti (Karin, Lawrence et al.
2006), sono potenti produttori di IL-6. L’ IL-6, in vivo , potrebbe quindi essere rilasciata
abbastanza precocemente durante i processi oncogenici sia dalle cellule trasformate che dalle
cellule mieloidi infiltranti il tumore.
Tutte le citochine che abbiamo testato e che si sono dimostrate efficaci nel generare le MDSC in
vitro agiscono sulla via di segnalazione che coinvolge il fattore di trascrizione C/EBPβ (Poli 1998;
Hirai, Zhang et al. 2006). Le “CAAT/enhancer-binding proteins” sono una famiglia di fattori di
trascrizione a cerniera di leucine, “leucine zipper”, implicati nella regolazione di vari aspetti della
80
differenziazione cellulare ed in particolare nel controllo del differenziamento mieloide in
condizioni infiammatorie. L’espressione di diverse isoforme di C/EBP è variabilmente indotta
durante la differenziazione macrofagica e/o granulocitaria (Rosenbauer and Tenen 2007) mentre
C/EBPα ed ε controllano la differenziazione in condizioni “steady-state”, C/EBPβ risulta
maggiormente espresso durante la mielopoiesi indotta da stress ed infiammazione (Hirai, Zhang
et al. 2006). I siti di legame di C/EBPβ sono stati identificati nelle regioni con funzioni
regolatorie di vari geni espressi dalle cellule appartenenti ai diversi “lineages” mielo-monocitari,
quali G-CSF, IL-6, IL-1β, TNF-α, IL-8, IL-12, geni codificanti per proteine importanti per le
funzioni macrofagiche o granulocitarie quali il lisozima, la mieloperossidasi, ed l’elastasi (Poli
1998).
Nella seconda parte di questo lavoro abbiamo dimostrato, per la prima volta, che il programma
tollerogenico delle MDSC dipende dal fattore di trascrizione C/EBPβ. Topi a cui sia stato deleto
il gene di C/EBPβ nel compartimento mieloide mostrano un marcato decremento dell’attività
immunosoppressiva delle MDSC sui linfociti T CD8+ garantendone un’attività terapeutica nel
guarire tumori stabilizzati (Fig.9-10-11). Risulta particolarmente interessante che, a questa perdita
dell’attività soppressoria in assenza della funzione del gene C/EBPβ, sia stata associata la
riduzione di una sottopopolazione di cellule CD11b+ che ha livelli bassi o intermedi di
espressione del marcatore Gr-1. Questa popolazione con caratteristiche immature, infatti, è
dotata della più elevata attività immunoregolatoria tra le sottopolazioni CD11b+ delle MDSC nei
topi portatori di tumore (Dolcetti, Peranzoni et al. 2009). Abbiamo quindi identificato in
C/EBPβ un bersaglio nuovo per un potenziale intervento che abbia lo scopo di revertire la
tolleranza indotta dal tumore, e rendere così maggiormente efficaci gli interventi di
immunoterapia.
C/EBPβ regola anche, direttamente o in associazione con altri fattori di crescita come STAT6, gli
enzimi che metabolizzano l’L-arginina e che sono associati con le funzioni immunosoppressive
delle MDSC quali Nos2 (Lowenstein, Alley et al. 1993) ed Arg1 (Pauleau, Rutschman et al.
2004). Non ci ha sorpreso, quindi, constatare che cellule mielodi infiltranti il tumore derivate da
topi con deleto il gene per C/EBPβ mostrassero una riduzione dell’espressione di questi enzimi,
e di altri enzimi che influenzano negativamente la proliferazione dei linfociti T (Fig. 12). Abbiamo
quindi messo in rilievo uno dei meccanismi attraverso cui questo fattore di trascrizione regola
l’attività delle MDSC.
81
La rappresentazione schematica riportata in figura 13 propone un modello che tenta di spiegare
dal nostro punto di vista come l’ambiente tumorale possa comunicare con siti ematopoietici
distanti per guidare la generazione di cellule mieloidi tollerogeniche.
I risultati ottenuti in questo lavoro individuano quindi, in C/EBPβ , un nuovo target molecolare
che può essere esplorato da un lato per incrementare ulteriormente il programma tollerogenico
delle cellule mieloidi, offrendo così un trattamento alternativo ai farmaci immunosoppressivi nei
trapianti d’organo e nelle malattie autoimmuni, e dall’altro lato può essere sfruttato limitandone
l’espressione, per ridurre l’impatto negativo generato dalle disfunzioni immunitarie indotte dal
tumore allo scopo di rendere più efficaci i protocolli di immunoterapia dei tumori, sia attiva che
passiva. Un approccio innovativo per interferire con l’attività di questo fattore trascrizionale
potrebbe essere l’impiego di molecole che siano in grado di silenziarlo trascrizionalmente, come i
miRNA. Recentemente infatti è stato dimostrato che il silenziamento del microRNA-155 nei topi
durante una risposta infiammatoria acuta porta alla down regolazione di C/EBPBβ e alla downregolazione di G-CSF (Worm, Stenvang et al. 2009). Nel nostro laboratorio, inoltre, sono in
corso studi sulla possibile regolazione di questa proteina da parte di miRNA differenzialmente
espressi nelle MDSC rispetto a cellule mieloidi non soppressive isolate dalla milza di animali sani.
82
Figura 13. Rappresentazione schematica della comunicazione tra microambiente tumorale e midollo osseo
che porta alla generazione di MDSC tollerogeniche.
Le cellule tumorali e stromali rilasciano citochine quali GM-CSF, G-CSF e IL-6 i cui livelli aumentano nel sangue
proporzionalmente alla crescita del tumore (1); queste possono indurre una seconda ondata di produzione delle
stesse citochine su organi bersaglio quali fegato e milza (2) e raggiungere il compartimento ematopoietico nel
midollo osseo (3). Nel BM le citochine attivano un programma alternativo di mielopoiesi basato sul fattore di
trascrizione C/EBPβ (4). Cellule mieloidi immature che esprimono CD11b e livelli intermedi o bassi di Gr-1 entrano
in circolazione (5) e raggiungono altri organi linfoidi quali la milza (6). Parte di queste cellule raggiungono anche il
sito tumorale dove il programma tollerogenico è ulteriormente supportato da C/EBPβ, che induce l’attivazione di
enzimi quali Nos2 and Arg1 (7).
83
84
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100
ABBREVIAZIONI
2β-Me ................................................................................................ 2-β-Mercaptoetanolo
Ab .......................................................................................................................... Anticorpo
ACT ................................................................................ Trasferimento adottivo cellulare
Ag ............................................................................................................................ Antigene
APC ..................................................................................... Cellula presentante l’antigene
ARG .......................................................................................................................... Arginasi
β-gal ............................................................................................................... β-galattosidasi
BM ................................................................................. “Bone Marrow” o midollo osseo
CD ............................................................................................. Cluster di differenziazione
CTL .................................................................................................Linfocita T citotossico
DC ............................................................................................................. Cellula dendritica
DNA-PK...................................................................... Protein chinasi DNA-dipendente
EDTA .............................................................................. Acido etilendiaminotetracetico
E.L.I.S.A. .......................................................... Enzyme-linked Immunosorbent Assay
FACS ....................................................................... Fluorescence Activated Cell Sorting
FBS ........................................................................................................ Siero fetale bovino
FITC ......................................................................................... Fluoresceina isotiocianato
G-CSF ....................................... Fattore stimolante la crescita di colonie di granulociti
GM-CSF .............. Fattore stimolante la crescita di colonie di granulociti e macrofagi
GvHD ........................................................................... Reazione di rigetto verso l’ospite
H2O2 ................................................................................................. Perossido di idrogeno
H&E ....................................................................................................Ematossilina eosina
HBSS.................................................................................. Hank’s Balanced Salt solution
HEPES ............................................... Acido 4-(2-idrossietil)-piperazin-1etansulfonico
IDO ........................................................................................Indolamina 2,3-diossigenasi
IFN ..................................................................................................................... Interferone
IL...................................................................................................................... Interleuchina
i.p. ............................................................................................................... Intraperitoneale
K.O. ..................................................................................................................... Knock out
LAK ........................................................................... Cellule Killer attivate da linfochine
L-Arg ................................................................................................................... L-Arginina
mAb .............................................................................................. Anticorpo monoclonale
MCA ............................................................................................................ Metilcolantrene
101
MHC ............................................................... Complesso maggiore di istocompatibilità
MLR ........................................................................................ Reazione leucocitaria mista
MLPC ........................................................ Coltura leucocitaria stimolata con il peptide
MDSC .................................................................................. Cellule mieloidi soppressorie
Nf-kB ...................................................................................................... Nuclear factor kB
NK ...................................................................................................... Cellule killer naturali
NKT ............................................................................................... Cellule T natural killer
NO................................................................................................................. Ossido nitrico
NOS ......................................................................................... Sintetasi dell’ossido nitrico
O2- .........................................................................................................Anione superossido
ONOO-............................................................................................................ Perossinitriti
PBS ........................................................ Phosfate buffer saline, soluzione salina fosfato
PCR ............................................................................. Reazione a catena della polimerasi
PE ............................................................................................ Phycoerythrin, Ficoeritrina
RAG2 ............................................................................ Recombination activating gene 2
RNOS ........................................................................... Specie reattive dell’ossido nitrico
ROS ........................................................................................ Specie reattive dell’ossigeno
s.c............................................................................................................................ Sottocute
SCID ...................................................................... Severe-combined immunodeficiency
SD .............................................................. “Standard Deviation” o deviazione standard
STZ.............................................................................................................. Streptozotocina
Teff ......................................................................................................................... T effettrici
Treg .................................................................................................................... T regolatorie
TAA ........................................................................................ Antigeni associati al tumore
TAP .......................................................................... Transporter associated with antigen
TCR .......................................................................... Recettore clonotipico dei linfociti T
TERT ................................................................................................................. Telomerasi
TGF-β .......................................................................... Fattore di crescita trasformante β
Th ............................................................................................................ Linfociti T helper
102
PUBBLICAZIONI OTTENUTE DURANTE IL DOTTORATO
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Dolcetti, L., I. Marigo, B. Mantelli, E. Peranzoni, P. Zanovello, and V. Bronte. 2008.
Myeloid-derived suppressor cell role in tumor-related inflammation. Cancer Lett
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Ugel, S., A. Zoso, C. De Santo, Y. Li, I. Marigo, P. Zanovello, E. Scarselli, B.
Cipriani, M. Oelke, J. P. Schneck, and V. Bronte. 2009. In vivo Administration of
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6
Peranzoni, E., S. Zilio I. Marigo, L. Dolcetti, P. Zanovello, S. Mandruzzato. and V.
Bronte. 2010 Myeloid-derived suppressor cell heterogeneity and subset definition. Cur
Opin Immunol. In press
103
104
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