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Quanto e come la diagnostica molecolare (CRD) ha cambiato o
: allergie
Rivista di Immunologia e Allergologia Pediatrica
01/2011 • 12-19
Quanto e come la diagnostica molecolare
(CRD) ha cambiato o cambierà le nostre
scelte nell’immunoterapia specifica (Parte II)
a cura della Commissione Immunoterapia Specifica della SIAIP
Annamaria Bianchi, Sergio Arrigoni1, Salvatore Barberi2, Lucia Caminiti3,
Giovanna De Castro4, Andrea Di Rienzo Businco6, Guglielmo Scala5,
Salvatore Tripodi6 (coordinatore)
Parole chiave: allergeni molecolari, panallergeni, CRD, CRIT, ITS, SCIT, SLIT
Abstract
Nella prima parte pubblicata sul numero 6/2010 sono stati introdotti i nuovi concetti di allergologia molecolare che consentono di definire meglio il profilo allergenico del singolo paziente (Component Resolved Diagnosis, CRD).
In questa seconda parte viene sottolineata l’importanza della CRD nei soggetti polisensibili per la scelta dell’ottimale ITS per
quel dato paziente, uno dei requisiti essenziali per la sua efficacia.
La nuova diagnostica di allergologia molecolare sta influenzando la produzione di estratti per ITS sempre più standardizzati
e caratterizzati, in particolare da quando è stato introdotto l’obbligo di registrare tali prodotti come farmaci.
In letteratura sono già stati pubblicati i risultati positivi di alcuni trial clinici di immunoterapia specifica effettuata con allergeni
molecolari, ricombinanti e/o naturali.
Nei prossimi anni saranno probabilmente disponibili tali vaccini in una formulazione adeguata a trattare un gran numero di
pazienti con un profilo allergenico compatibile, mentre l’ITS “tagliata su misura” per il singolo soggetto, rimarrà un’utopia
per i suoi costi improponibili.
Profilo allergenico del paziente
Essere allergico a una fonte allergenica non significa
necessariamente essere sensibilizzati a tutte le proteine allergeniche presenti in essa. Ogni paziente ha un
suo profilo di sensibilizzazione, cioè può avere IgEs
per molecole diverse dello stesso allergene e con diversa espressione quantitativa, che è in parte dipendente dall’esposizione ambientale e dalla genetica
del singolo soggetto 1(Fig. 1).
Nella pratica quotidiana, inoltre, è significativo il ri-
U.O.C. di Pediatria, Ospedale Mazzoni, Ascoli Piceno; 1 U.O.C di Pediatria, Ospedale “M. Melloni”, Milano; 2 U.O.C. di Pediatria,
Ospedale “Sant’Andrea”, Seconda Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università “La Sapienza”, Roma 2; 3 U.O. Allergologia Pediatrica,
Policlinico Universitario, Messina; 4 Clinica Pediatrica, Università “La Sapienza”, Roma; 5 U.O.S.D. Allergologia, “Loreto Crispi”, Napoli;
6 Servizio Dipartimentale Allergologia Pediatrica, Ospedale “Sandro Pertini”, Roma
[email protected][email protected]
Gli Autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interesse rispetto agli argomenti trattati nell’articolo.
12
Fig. 1. Immunoblotting del siero di pazienti diversi, sensibili al Phleum pratense (linee 1-51 e 58, 61), che presentano pattern differenti di sensibilizzazione IgEs per le diverse molecole (da Heiss et al., 1999 1, mod.).
scontro di pazienti con rinocongiuntivite e/o asma
allergica, che mostrino sensibilizzazioni multiple agli
SPT e/o al dosaggio delle IgE specifiche per estratti.
Spesso essi presentano sintomi severi e mal controllati con i farmaci e quindi sarebbero buoni canditati
all’ITS, ma viene loro negata proprio perché è difficile
individuare l’allergene/i principale/i.
In tali casi come ci si può orientare nella scelta della
ITS ottimale? Il problema maggiore è capire se questa
polisensibilizzazione è il risultato di una “co-sensibilizzazione”, cioè una sensibilizzazione vera a molte e
distinte molecole allergeniche di fonti diverse, o invece di un “co-riconoscimento o cross-reattività”, legato
alla sensibilizzazione ad allergeni diversi che condividono epitopi simili 2 o, infine, se coesistono entrambe
le situazioni.
La CRD, identificando i markers di sensibilizzazione
primaria e quelli di cross-reattività, consente di distinguere tra una vera ed una falsa polisensibilizzazione,
A. Bianchi et al.
così da indirizzare meglio la scelta di una immunoterapia per gli allergeni markers primari. Alcuni recenti
estratti per ITS sono già standardizzati in base a tale
contenuto, espresso in ng o mcg, e tale procedura
sarà obbligatoria con i nuovi prodotti che dovranno
essere registrati come farmaci, come alcune SLIT verso
graminacee già in commercio 3-5.
Accanto alla diagnostica in vitro sono attualmente
disponibili alcuni estratti per test in vivo a contenuto
noto per molecole cross-reattive, quali quello per profillina purificata (Pho d 2 a concentrazione di 50 µg/
mL) e polcalcina (concentrazione 500 µg/mL) entrambe ottenute dalla palma di dattero 6. Un loro uso nella
routine richiederà certamente altri studi per meglio
definirne sensibilità e specificità, ma quasi certamente
a breve un approccio diagnostico di tipo molecolare
sarà possibile anche con gli SPT.
Dal punto di vista pratico proponiamo, nelle Figure 2
e 3, un semplice schema ed un algoritmo, che da esso
13
La CRD, poiché consente di
distinguere tra una vera ed
una falsa polisensibilizzazione,
permette di indirizzare meglio
la scelta di una immunoterapia
per gli allergeni markers
primari.
deriva, che possono aiutare a scegliere quali molecole markers di sensibilizzazione primaria e/o panallergeni sono da testare per definire il profilo allergenico
del paziente polisensibile a pollini al fine della prescrizione della migliore ITS.
Qualità e caratterizzazione dei prodotti
per la diagnostica e l’ITS
La diagnostica molecolare ha messo in luce anche un
altro grosso problema, a lungo inaffrontato e tuttora
parzialmente risolto, che è quello della qualità e caratterizzazione dei prodotti usati nella diagnostica e
nell’immunoterapia.
Gli estratti allergenici utilizzati, infatti, sono una “imprevedibile miscela di componenti allergeniche e
non” 7. Il termine imprevedibile non è usato a caso,
poiché la loro composizione è influenzata da moltissimi fattori.
Il diverso contenuto di molecole allergeniche dipende infatti dal tipo di materiale grezzo usato dalle ditte per produrre l’estratto 8. Nel caso dei pollini, per
esempio, tale contenuto può variare in funzione della
varietà di pianta coltivata 9, condizioni climatiche 10,
stadio di maturazione del polline 11, fattori ambientali
Fig. 2. Principali molecole markers di sensibilizzazione primaria e di cross reattività per i pollini; per le polcalcine e le profilline sono evidenziate in grassetto le molecole il cui dosaggio è consigliato (modificate da R. Asero).
14
Quanto e come la diagnostica molecolare (CRD) ha cambiato o cambierà le nostre scelte nell’immunoterapia specifica (Parte II)
Fig. 3. Algoritmo per la diagnosi di co-sensibilizzazione e/o riconoscimento nei pazienti polisensibili a pollini
(SPT e/o IgEs per estratti positivi), dosando le IgEs per markers di sensibilizzazione primaria e di cross reattività.
e di crescita 12 13, grado di idratazione del polline 14,
condizioni di conservazione. Ma sono soprattutto i
metodi di estrazione e di trattamento che maggiormente influenzano la presenza degli allergeni e la
loro possibile degradazione 15 16.
Esemplificativo in tal senso è lo studio di Focke 17 in
cui si dimostra come gli estratti per pollini di graminacee di differenti case produttrici presentano una
considerevole eterogeneità nel contenuto delle singole
molecole allergeniche e quindi una diversa risposta in
vivo (SPT) .
A questo va poi aggiunto il problema della standardizzazione. Fino a pochi anni fa questa era esclusivamente una standardizzazione “di tipo biologico”, connessa alla capacità dell’estratto di legare le
IgEs 18. Tale caratteristica viene misurata sulla base
della reattività cutanea, attraverso prick test e con test
competitivi per le IgE quali RAST o ImmunoCAP inibizione 19. Ogni ditta produttrice di vaccini allergenici
esprime, perciò, la potenza del proprio prodotto con
una propria unità di misura, riferita esclusivamente
ad uno standard interno utilizzato (In-House Reference Standard - IHR) e questo rende i diversi prodotti
non confrontabili tra loro. L’altro problema della stan-
A. Bianchi et al.
dardizzazione biologica, emerso con l’avvento degli
allergeni ricombinanti, è che questa non dà alcuna
informazione relativa al contenuto di allergene maggiore specie-specifico nel vaccino.
Negli anni ’90, quando la maggior parte degli allergeni maggiori e minori furono identificati e resi disponibili come allergeni ricombinanti, si fece strada
il concetto che l’efficacia dell’ITS è legata ad una definita quantità di allergene maggiore. La WHO Position Paper del 1997, sulla base della revisione di 20
studi che confrontavano le dosi di allergene maggiore
usate con successo nei preparati per immunoterapia,
concludeva che “c’era una buona evidenza, da studi
di immunoterapia con ambrosia, graminacee, acaro,
gatto e veleno di imenotteri, che una dose di mantenimento per via iniettiva di 5-20 µg di allergene maggiore era associato ad un significativo miglioramento
dello score sintomatologico del paziente 20. Successivi studi sull’efficacia dell’immunoterapia nell’allergia
all’epitelio di cane e gatto hanno confermato questa
dose di mantenimento 21-23. Si raccomandava quindi
l’uso di preparati per ITS standardizzati, di contenuto
allergenico noto, al fine di ottenere il maggior grado
di efficacia.
15
Fu così che WHO/IUIS Committee, con lo scopo di
rendere confrontabili i prodotti per immunoterapia e
fornirne accurate informazioni relative al loro contenuto in componenti attive (allergene maggiore), diede
il via nel 2001 ad un progetto europeo, denominato
progetto CREATE 24 finalizzato a raggiungere degli
standard di riferimento (reference standards) e dei
metodi analitici uguali per tutti. Quali reference standards furono identificate nove molecole ricombinanti
(rBet v1, rPhl p 1, rPhl p 5a e rPhl p 5b, rOle e 1, rDer
p 1, rDer p 2, rDer f 1 e rDer f 2) per gli otto allergeni maggiori e confrontate con gli allergeni naturali
purificati, per caratteristiche fisico-chimiche (identità,
purezza, ripiegamenti, stato di aggregazione, solubilità e stabilità) ed immunologiche (potenza di legame
con le IgE, attività biologica e curva dose-risposta in
ELISA). Di questi solo tre, rBet v1, rPhl p 5a, rDer p 2,
mostravano una sufficiente somiglianza strutturale ed
immunologica, nonché potenza biologica, analoga
alla controparte naturale, tanto da poter essere considerati come materiale di riferimento internazionale.
Due di questi ricombinanti allergenici, qualificati da
CREATE come buoni candidati di riferimento, sono
stati poi utilizzati in trial clinici di immunoterapia: rBet
v1 25, rPhl p 5a 26.
L’altro problema era standardizzare le metodiche dei
dosaggi immunologici necessari alla quantificazione
dell’allergene maggiore nell’estratto. La metodica
scelta fu quella del sandwich enzyme-linked immunoassorbent assays (ELISAs). I risultati ottenibili con tale
metodica sono legati alla diversa specificità che gli
anticorpi monoclonali (mAb) usati possono avere per
le differenti isoforme di una molecola allergenica 27 28.
L’anticorpo monoclonale è estremamente specifico;
esso, infatti, non riconosce tutta la proteina, ma solo
una ristretta regione di questa, l’epitopo. Ne consegue che tale mAb può non riconoscere tutte le isoforme presenti in un estratto alla stessa maniera o, in casi
estremi, può non riconoscere una specifica isoforma. È
quanto osservato nello stesso progetto CREATE, quando per la misura del Phl p 5 e del gruppo 2 dell’acaro
della polvere venivano usati rispettivamente il rPhl p
5b e il rDer p 2.01.01 come standard 19.
Uno sforzo in questo senso, ultimamente, si è fatto nei
prodotti per SLIT registrati come farmaci (Grazax® e
Oralair®), in cui le case produttrici dichiarano una
quantità precisa e riproducibile almeno dell’allergene
maggiore Phl p 5 3 4.
C’è però da dire che alcuni autori sostengono che la
vera potenza di un estratto non dipende solo dalla
16
Il diverso contenuto di
molecole allergeniche usate
negli estratti allergenici ha
messo in luce un problema
di standardizzazione
delle metodiche dei
dosaggi immunologici e di
standardizzazione “biologica”
dei prodotti utilizzati.
quantità di allergene maggiore, ma dalla sua globale attività biologica dovuta anche alla presenza degli
allergeni minori. Non a caso si suggerisce che il confronto tra gli estratti per ITS di diverse aziende venga
fatto esclusivamente sulla base di trial clinici 29.
Component Resolved Immunotherapy (CRIT)
Da quanto su esposto, uno dei principali problemi
dell’immunoterapia specifica è quello di utilizzare
estratti naturali di scarsa qualità 30, ottenuti direttamente da una sorgente allergenica grezza, in cui gli
allergeni più importanti o non sono presenti in quantità sufficiente o mostrano una scarsa immunogenicità 17 31.
Per tale motivo negli ultimi anni è cresciuto l’interesse
verso forme di immunoterapia che utilizzino allergeni
molecolari (ricombinanti e/o naturali).
In questo senso trial clinici sono stati fatti utilizzando
allergeni ricombinanti, sia come mix in modo da riprodurre l’estratto naturale 32 sia come ricombinanti
allergenici modificati, che abbiano una ridotta attività
allergenica 33-35, dimostrando che tale tipo di immunoterapia può essere efficace e sicura. In questo contesto
è necessario dimostrare che tali formulazioni abbiano
la stessa potenza degli allergeni naturali completi e
che il pannello degli allergeni ricombinanti includa
tutti gli epitopi riconosciuti dalle cellule B e T.
Nel caso delle graminacee in uno studio randomizzato in doppio cieco contro placebo (DBPC) è stato
dimostrato che un pannello di cinque ricombinanti (Phl
Quanto e come la diagnostica molecolare (CRD) ha cambiato o cambierà le nostre scelte nell’immunoterapia specifica (Parte II)
p1, Phl p2, Phl p5a e Phl p5b, Phl p6) è in grado di
ridurre in maniera significativa i sintomi e l’utilizzo
dei farmaci in pazienti con rincongiuntivite allergica
da graminacee e di indurre una potente risposta IgG
specifica 32. Inoltre, dato degno di nota, 4 pazienti
che non avevano IgEs per Phl p 5a/b, non le hanno
prodotte a seguito della SCIT che anzi ha indotto
una risposta di IgG1 e IgG4 specifiche verso tali
molecole.
In un altro studio multicentrico randomizzato DBPC,
132 pazienti adulti sono stati sottoposti ad immunoterapia sottocutanea utilizzando 3 tipologie di vaccino
(rBET v1, nBet v1 ed estratto di betulla). Miglioramento
clinico e ridotto uso dei farmaci è stato rilevato in tutti
e tre i gruppi, ma un più alto livello di IgG specifiche
si è rilevato nel gruppo trattato con rBet v1 36.
Recentemente un nuovo specifico trattamento immunoterapico per alternaria con allergene nativo purificato (nAlt a1) è stato introdotto nel mercato, mostrando
una buona immunogenicità e sicurezza 37.
Infine, un’applicazione particolare della diagnostica
molecolare è il dosaggio delle IgG specifiche per allergeni molecolari che potrebbe essere usato per monitorare l’efficacia della ITS, come documentato per le
IgG4s per Phl p 5 il cui incremento, dopo 2 anni di
SCIT, correla con l’efficacia clinica, mentre tale dato
non è stato osservato per il livello delle IgEs 38.
Conclusioni
Nell’immunoterapia allergene-specifica l’identificazione dell’allergene causa della malattia è fondamentale requisito per la riuscita del trattamento. E questo è
particolarmente importante se si considera che più del
60% 39 dei pazienti allergici ai pollini sono polisensibilizzati. In questo quadro di polisensibilità, conoscere il profilo allergologico di un paziente e quindi
poter distinguere tra sensibilizzazione verso markers
di cross-reattività (profilline, polcalcine) e markers di
sensibilizzazione primaria, costituisce il cardine per
la scelta di un’ITS.
Le nuove possibilità di diagnostica molecolare ci consentono già oggi di ottenere tali risultati, anche se tuttora esistono problemi non risolti di classificazione,
nomenclatura e significato clinico specie per le molecole cross-reattive, con dati a volte contrastanti tra i
vari studi pubblicati.
Non va mai dimenticato però che i risultati dei test
in vivo e/o vitro vanno, come sempre, correlati alla
A. Bianchi et al.
storia clinica del paziente, poiché la sensibilizzazione
verso un allergene non necessariamente implica una
reazione clinica.
Le nuove conoscenze di CRD stanno, inoltre, provocando un processo di “selezione naturale” delle case
produttrici di ITS, perché le costringe a preparare prodotti di qualità e standardizzazione sempre migliore
e meglio caratterizzati sotto il profilo molecolare. Un
buon indicatore per il prescrittore di ITS è anche quello di basarsi, nella scelta del produttore di un vaccino
per immunoterapia, sul numero e qualità di studi da
esso sponsorizzati (certo sarebbe meglio poter contare su studi indipendenti!) che documentino l’efficacia
e sicurezza del prodotto per le varie fascie d’età.
I costi eccessivi per la produzione, commercializzazione e, soprattutto, registrazione di vaccini con specifiche molecole, sia ricombinanti sia naturali, probabilmente escludono la possibilità di CRIT fatta su
misura per il singolo paziente.
Nel giro di pochi anni i risultati degli studi in corso
(www.clinicaltrials.gov) che utilizzano miscele di molecole di una stessa sorgente capaci di coprire un
ampio spettro di sensibilizzazione di un gran numero
di pazienti con un profilo allergenico compatibile (es.
Der p 1 e Der p 2 per gli allergici agli acari, o Bet
v 1 per quelli allergici alla Betulla, Fel d 1 per il gatto, Phl p 1/2/5/6 per le graminacee) probabilmente
consentiranno di avere dei prodotti standardizzati con
contenuto definito degli allergeni costituenti. Ciò, finalmente, farà fare all’ITS il salto di qualità dalla fase
empirica di prodotti a “miscela ignota” a “veri e propri farmaci”.
Risoluzione del caso clinico
La CRD ha documentato la presenza di IgEs per Phl p
1, Phl p 5, Phl p 12 e negatività per Bet v 1, Ole 1 e
Par j 2, pertanto a Marco è stata prescritta una SLIT
per graminacee a contenuto noto e standardizzato di
Phl p5.
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