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Meccanismi di azione degli erbicidi e basi genetiche e

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Meccanismi di azione degli erbicidi e basi genetiche e
Meccanismi di azione degli erbicidi e
basi genetiche e fisiologiche della
resistenza
CNR -Istituto di Biologia Agro-ambientale e Forestale (IBAF)
Unità di Legnaro
L. Scarabel, M. Sattin , G. Zanin
Sommario
¾ Resistenza e impatto della nuova legislazione
europea sui prodotti fitosanitari
¾ Erbicidi e meccanismi d’azione
¾ Meccanismi di resistenza delle malerbe
¾ Casi di studio: situazione della resistenza in
2 sistemi colturali
Un uso sostenibile e responsabile degli erbicidi
appare indispensabile
La resistenza è un fenomeno evolutivo
L’uso ripetuto dello stesso erbicida o erbicidi
aventi il medesimo meccanismo d’azione
elimina ripetutamente le piante suscettibili
mentre quelle resistenti possono riprodursi e
disseminare formando cosi anche in breve
tempo una popolazione resistente.
Famiglie chimiche diverse con
medesimo meccanismo d’azione
selezionano nella medesima
direzione
Quali sono i fattori che influenzano
l’evoluzione della resistenza
• La variabilità iniziale presente nella popolazione
infestante relativamente al gene bersaglio
dell’erbicida
• Il sistema di riproduzione della specie e il
meccanismo di ereditarietà della mutazione
• La “fitness” degli individui resistenti
• Il flusso genico
Prodotti fitosanitari
-situazione in evoluzione¾Riduzione dei p.a. disponibili in commercio
Riduzione dei meccanismi d’azione per coltura
Minore opportunità di ruotare erbicidi aventi diversi
MdA
¾Mancanza di introduzione sul mercato di prodotti
nuovi con un diverso meccanismo d’azione
¾Concentrazione su pochissimi meccanismi ad alto
rischio di resistenza
Ricadute sul rischio di insorgenza e di evoluzione
della resistenza
Erbicidi e meccanismi d’azione (MdA)
¾L’ azione fitotossica degli erbicidi è dovuta alla
loro capacità di agire su processi fisiologici e
biochimici vitali per la pianta: fotosintesi, sintesi
aminoacidi, sintesi lipidi….
¾Per meccanismo di azione si intende il
meccanismo la precisa lesione biochimica
(inibizione di una proteina enzimatica) o biofisica
(trasporto degli elettroni) determinata dall’erbicida
Erbicidi e meccanismi d’azione (MdA)
¾Varie classificazioni disponibili ma quella
dell’HRAC (Herbicide Resistance Action
Committee) che si basa sul meccanismo
d’azione degli erbicidi facilita la scelta degli
erbicidi nella prevenzione/gestione della
resistenza
¾Consente all’agricoltore di impostare un corretto
piano di diserbo alternando erbicidi con
meccanismo d’azione diverso.
HRAC-gruppo B-inibitori dell’acetolattato-sintasi
(ALS)
Solfoniluree
Imidazolinoni
In totale, 26 sostanze
attive autorizzate in Italia
che corrisponde a un
quarto degli erbicidi sul
mercato italiano
(fonte: GIRE)
SCT
Triazolopirimidin
e
Pirimidili(tio)benzoati
ƒ Il gruppo chimico
più rappresentato
è quello delle
solfoniluree
HRAC-gruppo B-inibitori dell’acetolattato-sintasi
(ALS)
ƒ Inibitori della sintesi degli aminoacidi a catena
ramificata (Val, Ile, Leu)
ƒ Straordinaria attività biologica: pochi grammi di
principio attivo per ha
ƒ Alta selettività
ƒ Controllo delle principali dicotiledoni, recente
introduzione di SU con attività gramminicida
(mesosulfuron + iodosulfuron nei cereali)
ƒ Trattamento prevalentemente in postemergenza
HRAC-gruppo A-inibitori dell’acetil-coenzima A
carbossilasi (ACCasi)
Cicloesenoni (DIMs)
Arilossi-fenossipropionati (FOPs)
Attualmente , 12 sostanze
attive autorizzate in Italia
(fonte:GIRE)
pinoxaden
Fenilpirazoline
(DEN)
• Graminicidi
• Selettivi
• Trattamenti in post-emergenza
HRAC-gruppo G-inibitore dell’EPSP sintasi
Glifosate
• Inibitore dell’enzima EPSP sintetasi che
interviene nella biosintesi
degli aminoacidi
aromatici (Phe, Trp, Tyr) e di composti aromatici
della pianta (acido folico, flavonoidi, vit. K, E)
• Erbicida sistemico non-selettivo
• Impiegato dal 1974, efficace contro infestanti
annuali e perenni
• Presente nei più vari sistemi colturali (colture
arboree) e con molti usi extra-agricoli
Altri meccanismi d’azione (MdA)
Gruppo O con gli erbicidi auxino-simili: 2,4-D,
MCPA, MCPP
Gruppo C Inibitore della fotosintesi: triazine
(terbuthylazine),
triazinoni
(metamitron,
metribuzin), ammidi (propanile)
Meccanismi di resistenza
¾ 2 principali meccanismi:
ƒ Mutazioni “target site” – l’erbicida non riesce
a legare l’enzima bersaglio per una
variazione sopraggiunta nel sito di legame
Resistenza target-site
ƒ Resistenza non target-site (NTSR)
Resistenza target-site
Resistenza agli inibitori del PSII
La triazina, la
fenilurea e gli erbicidi
uracilici inibiscono il
fotosistema II
legandosi alla
proteina D1 e
bloccando il trasporto
degli elettroni. Nelle
piante resistenti c’è
una mutazione
puntiforme nel gene
cloroplastico che
codifica per la
proteina D1
Meccanismi di resistenza NTSR
• Assorbimento ridotto – l’erbicida non è assorbito
in quantità letali.
• Traslocazione ridotta– l’erbicida non è
trasportato nella pianta nel sito dove svolge la
sua attività.
• Sequestro – l’erbicida è fisicamente rimosso dal
sito in cui svolge la sua attività (es. nel vacuolo)
Meccanismi di resistenza NTSR
Resistenza metabolica: l’erbicida è detossificato
prima che possa raggiungere il sito di azione.
Sistemi enzimatici che intervengono nel
processo di detossificazione:
•Il sistema delle monoossigenasi a funzione
mista comprendenti il citocromo P450 (mfo-P450)
•Il sistema del glutatione –glutatione S transferasi
(G-GST)
Ereditarietà monogenica della resistenza
• La resistenza ALS e ACCase è a eredità
nucleare con parziale o totale dominanza.
Il gene di resistenza “viaggia” con il polline
• Caso di resistenza al trifluralin in Setaria viridis
dove la resistenza è controllata da un gene
nucleare recessivo
La diffusione di una mutazione recessiva è
favorita se la specie è autogama e se è molto
prolifica.
Ereditarietà monogenica della resistenza
La resistenza alle triazine
è ad eredità materna.
Una resistenza con eredità materna si fissa
molto velocemente in una popolazione
infestante a seguito del trattamento
erbicida, poiché tutta la discendenza di una
pianta resistente è resistente.
Ereditarietà poligenica della resistenza
¾ Affinchè la pianta sia resistente, deve
accumulare un numero sufficiente di alleli
favorevoli alla costituzione di un fenotipo
resistente (numerose generazioni)
¾ L’ereditarietà è più lenta e la popolazione di
malerbe incrementa gradualmente il livello di
resistenza
Fitness
¾ Nella maggior parte dei casi, la resistenza non
ha un evidente costo biologico quindi in
assenza di erbicida i genotipi resistenti hanno
fitness simile a quella dei genotipi sensibili
¾ Eccezione:
Solanum
nigrum
resistente
all’atrazina ha una riduzione significativa della
fitness rispetto alle piante S.
La sospensione dell’erbicida selezionatore,
determinerà un aumento graduale dei genotipi
S rispetto agli R (diverso equilibrio allelico)
Riso
Tipologie di semina:
ƒSemina in acqua
(70-75%)
ƒSemina
(25-30%)
Monosuccessione prevalente,
anche 20-30 anni
interrata
ƒFonte:
www.enterisi.it
ERBICIDI PRE‐SEMINA
P. A.
MECCANISMO DI AZIONE
HRAC
Flufenacet
Oxadiazon
Cycloxydim
Glyphosate
Inibitore divisione cellulare
Inibitore PPO
Inibitore ACCasi
Inibitore EPSPS
K3
E
A
G
INFESTANTI TARGET
GRAM
DICOT
++
+
+
++
++
++
ERBICIDI PRE‐EMERGENZA
P. A.
MECCANISMO DI AZIONE
HRAC
Clomazone
Pendimethalin
Inib. biosintesi carotenoidi
Inibitore microtubuli
F3
K1
INFESTANTI TARGET
GRAM
DICOT
++
++
+
ERBICIDI POST‐EMERGENZA
P. A.
MECCANISMO DI AZIONE
MCPA
Triclopyr
2,4‐DB
Propanile
Cyhalofop butyl
Profoxydim
Azimsulfuron
Imazosulfuron
Penoxsulam
Bispyribac‐Na
Imazamox
Bensulfuron‐methyl
Halosulfuron‐methyl
Bensulfuron+Metsulfuron
Orthosulfamuron
Ethoxysulfuron
Metosulam
Azione auxino‐simile
Azione auxino‐simile
Azione auxino‐simile
Inibitore fotosintesi
Inibitore ACCasi
Inibitore ACCasi
Inibitore ALS
Inibitore ALS
Inibitore ALS
Inibitore ALS
Inibitore ALS
Inibitore ALS
Inibitore ALS
Inibitore ALS
Inibitore ALS
Inibitore ALS
Inibitore ALS
HRAC
P
O
P
C2
A
A
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
INFESTANTI TARGET
GRAM
DICOT
++
++
++
++
+
++
++
++
+
++
++
+
++
+
++
+
++
++
++
+
++
++
++
Sistema colturale riso
¾Utilizzo prolungato e continuativo di erbicidi con
il medesimo meccanismo d’azione: soprattutto
inibitori dell’ALS in post-emergenza.
¾ Perdita di p.a. in commercio: es. quinclorac
Pochi giorni fa deroga per l’uso del propanile a
dose ridotte.
Pratiche che determinano una elevata pressione
di selezione che favorisce l’insorgenza di
popolazioni di infestanti resistenti
Echinochloa spp
Spettro di resistenza Echinochloa crus-galli in riso
Eterogeneità dei pattern di resistenza
Inibitore
ACCasi
Inibitori
ALS
Echinochloa crus-galli
¾ Specie annuale a ciclo estivo molto competitiva
¾In grado di colonizzare sistemi colturali molto
diversi: riso, mais, pomodoro, soia e bietola
¾Alta produzione di semi che rimangono vitali nel
terreno per diversi anni anche in condizione di
sommersione
Scalarità delle
emergenze:
anche 4-5 flussi
se c’è acqua
Dose-risposta
Echinochloa crus-galli in riso
Sopravvivenza
Erbicida
Inibitori ACCasi
Inibitori ALS
profoxydim
Pop.
penoxsulam
Imazamox
ED50*
RI** 07‐16
ED50
RI 07‐16
ED50
RI 07‐16
74 (4.4)***
‐
26 (1.5)
‐
22 (1.2)
‐
09‐42L
‐
‐
>652
>25
>576
>26
09‐44a
171 (3.9)
2.3
>652
>25
>576
>26
09‐44c
181 (6.8)
2.4
>652
>25
>576
>26
09‐45
‐
‐
>652
>25
>576
>26
09‐46
‐
‐
>652
>25
>576
>26
07‐16 (S)
* dose che causa il 50% dell’effetto ** Resistance index *** g a.i. ha-1 (errore standard)
Basi molecolari della resistenza agli
inibitori dell’ALS in E. crus-galli
Acetolattato sintasi: enzima coinvolto nella biosintesi de novo
degli aminoacidi a catena ramificata, valina, leucina e isoleucina.
5’ -
C
A122
A
F
B
E
D376
W574
S653
D
ECH-5F
P197 A205
3’
ECH-3R
3RACE-1
R377
ECH-3F
AAAAA(n) -
G
654
3RACE-2
dT24VN
dT24VN
5RACE-1
Mutazioni
che5RACE-1
causano la resistenza agli erbicidi
ECH-4F
Mutazione in posizione 574:
WT
Causa cross-resistenza a
tutte le famiglie di ALS con
alti livelli di resistenza
Trp
Leu
MUT
Copie del gene ALS espresse nel
genoma di E. crus-galli
Pianta S + Pianta R
- 2 cluster identificati in tutte le piante analizzate
- La mutazione 574 è presente in tutte le pop analizzate nel Gene 1 (sia in
omozigosi che in eterozigosi)
Marcatore molecolare
AS-CAPS = Allele Specific - Cleaved Amplified Polymorphic Sequences
Identificazione polimorfismi per
distinguere Gene 1 da Gene 2
Costruzione
primer genespecifici sui
polimorfismi
590 e 621
Identificazione di
un sito di taglio per
l’enzima BtsI in
posizione 574
Validazione
S
215
145
70
R
S
215
R
Sostenibilità impiego erbicidi
In presenza di Echinochloa spp. resistenti agli
erbicidi inibitori dell’ALS nella risaia:
¾ Intervenire con prodotti in pre-semina e preemergenza su infestanti in una fase
sensibile del loro ciclo vitale
¾ Intervenire in post-emergenza con prodotti a
base di profoxydim e/o cyhalofop butyl
Sostenibilità impiego erbicidi
In presenza di Echinochloa spp. con resistenza
multipla agli inibitori dell’ALS e agli ACCasi in risaia
Gestione problematica; è assolutamente
necessario adottare strade alternative al diserbo
Rotazione delle colture: riso-mais o riso-soia.
Semina tardiva; interventi in pre-semina con prodotti
aventi un diverso MdA.
In post-emergenza, l’unico prodotto disponibile in soia è il
clomazone mentre in mais ci sono più prodotti disponibili
Tecniche agronomiche: lavorazioni del terreno per
contenere le malerbe prima della semina e utilizzo di
varietà a ciclo più precoce, ma diminuisce la resa
Linee guida specifiche per la gestione
della resistenza in vari sistemi colturali
Attualmente disponibili per:
riso, cereali, colture
sarchiate ed erba medica
www.resistenzaerbicidi.it
Resistenza al glifosate in colture arboree
•332 Vigneti dell’Astigiano
> 300 ha infestati
20 anni uso glifosate
1‐2 trattamenti all’anno
.
•335, vicino al vigneto 332, controllo meccanico
.
336 Oliveti del Leccese
migliaia di ha infestati
>20 anni uso glifosate
2-3 trattamenti
all’anno
Caratteristiche comuni:
Nessuna lavorazione
Uso intensivo di glifosate
Lolium resistente al glifosate
¾ Alta pressione di selezione esercitata dall’uso
continuo di glifosate ha portato alla resistenza
¾ Negli oliveti:
- attrezzatura per trattare spesso inadeguata
- applicazioni spesso con alti volumi d’acqua
(700- 1000 L/ha)
Attrezzatura
inefficiente
Meccanismo di resistenza target-site
Mutazione in posizione 106 del gene EPSPS
204L:
332:
CCA proline (wt)
CCA proline (wt)
336:
CCA-CTA Pro-Leu
CCA-TCA Pro-Ser
CTA-TCA Leu-Ser
TCA-TCA Ser-Ser
Ser
Pro
(wt)
Leu
La mutazione determina un moderato livello di
resistenza al glifosate (indice di resistenza < 5)
S-204 (g a.e ha-1 )
NT 67.5 135 180
270
R-332
NT 270
720 1080
R-336
NT 270
360
360
540
540
720
360
1080
540
720
1440 1620 2160
1440 1620
3240 4320 8640
2160 3240 4320 8640
Collavo A. e Sattin M. 2012, Weed research 52, 16-24
14-24 hour chase
period spectra
R
336
NMR, esperimento
PULSE-CHASE
Le piante R accumulano
glifosate nel vacuolo
mentre diminuisce il
glifosate nel citoplasma
S 204
Più veloce nella R336
che nel R332
Xia Ge et al 2012
Agric. Food. Chem 60, 1243-1250
Lolium spp. resistente
¾ Variabilità di meccanismi di resistenza
¾ Variabilità livelli di resistenza
¾ Finora no resistenza multipla (solo shifting con
fluazifop)
¾ Attenzione al pollen flow
¾ Effetto delle condizioni climatiche al momento del
trattamento: maggiore efficacia a basse t° (10°
rispetto a 20°C)
Sostenibilità impiego erbicidi
¾ Inserire/preservare elementi di discontinuità
temporale e spaziale
¾ Limitare le aree trattate (inerbimento interfila)
Si riduce la pressione di selezione
¾ Utilizzo di miscele (prima di avere problemi di
resistenza) per contrastare la comparsa di
flora di sostituzione
¾ Rispettare le dosi
¾ Implementare il controllo meccanico
Diserbo sottofila
¾ In miscela con glifosate: flazasulfuron (inibitore
dell’ALS)
1 volta l’anno ogni 2 anni
¾ Carfentrazone (triazolinoni)
¾ Ciclossidim e fluazifop: graminicidi (inibitori
ACCasi)
Considerazioni conclusive
¾ Maggiore consapevolezza del problema della
resistenza perché non diventi un fattore
limitante per l’agricoltura italiana
¾ È indispensabile ampliare o almeno mantenere
il numero dei meccanismi d’azione utilizzabili
¾ Quale impatto ha la conoscenza delle basi della
resistenza?
Limitato
sulla
gestione
e
significativo sull’industria
¾ Occorre allineare tutti i consigli tecnici alle
misure di gestione integrata e di prevenzione:
diversificare gli interventi in campo (mezzi
chimici e non) su larga scala
Considerazioni conclusive
¾Necessità di integrare le conoscenze, approccio
multisciplinare e diffusione in tutta la filiera; alcune
semplici misure non sono state ancora
implementate. Es. etichette
¾Maggiore professionalità
¾Non dimenticare che la resistenza è un costo; le
misure curative con resistenza in atto comportano
un costo medio superiore di 3-5 volte rispetto a
quelle preventive
Grazie per l’attenzione
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